本发明专利技术涉及生物医药和基因工程领域，提供了一种针对乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)的单克隆抗体(命名为KY01)及其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列，以及制备HBx单克隆抗体KY01的方法和可生产KY01抗体的杂交瘤细胞系。所述的KY01抗体能够特异性识别乙型肝炎病毒已知8种基因型中7种基因型(A、B、C、D、E、F和H)编码的X蛋白，并与其中第61-120位氨基酸区段特异结合，与HBx蛋白其它部位、HBV其它蛋白、FLAG标签和人蛋白组无特异性反应。本发明专利技术的KY01抗体可用于针对HBx蛋白的免疫检测和特异性细胞靶向，为研发HBV感染及其它相关疾病的诊断和治疗方法提供支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药和基因工程领域，具体涉及一种可特异性识别7个亚型人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)的单克隆抗体及其在制备诊断和治疗HBV感染与相关疾病如肝细胞癌(HCC)的药物中的应用。
技术介绍
有报道公开了由HBV感染引起的乙型肝炎以肝脏炎性病变为主，并可并发多器官损害。HBV感染慢性化为慢性乙型肝炎(CHB)后，还可引发肝纤维化、肝硬化、原发性肝细胞癌(HCC)和肝衰竭，导致死亡。近年来，随着HBV疫苗的成熟和预防接种的推广，新发HBV感染率显著下降，但全球仍然有3.5亿左右HBV慢性携带者，每年约1百万患者死于HBV感染相关疾病(Lavanchy 2004)。中国属HBV感染高发区，约有1.2亿慢性携带者和3000万慢性乙型肝炎患者(Liu，Si et al.2002)。有研究公开，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)由HBV的X基因编码，包括154个氨基酸残基(Tiollais，Pourcel et al.1985)。已知的8种HBV基因型(A型-H型)均编码相同长度的HBx蛋白，不同基因型HBx之间的氨基酸序列同源性可低至70％左右。培养细胞中的研究表明，HBx在细胞内易发生降解，半衰期约30分钟左右，因此通常在细胞内以较低水平存在(Schek，Bartenschlager et al.1991)。已有研究表明HBx是HBV诱发肝癌的重要因素之一。HBx不仅存在于HBV相关HCC病人的肿瘤组织中，也存在于非肿瘤组织中(Moriarty，Alexander et al.1985；Wang，London et al.1991；Diamantis，McGandy et al.1992)。对HBV感染患者肝脏和血清中HBx蛋白或相应抗体进行连续检测，对于研究急/慢性HBV感染患者的病程进展，特别是HBV相关HCC的早期发现、发展观察和疗效评价，具有现实的临床意义。此外，由于HBx仅在HBV感染细胞中表达，且不具备分泌信号肽，故通常情况基本不进入患者血液，因此，HBx同时也是靶向性治疗慢性乙型肝炎和HBV相关HCC的重要靶标分子。针对HBx的基础和临床研究与应用需要具有高特异性和广泛反应性的HBx单克隆抗体，在此基础上，本申请的专利技术人拟开发HBx蛋白及抗体的检测系统、针对表达HBx细胞的靶向性工具等诊断和治疗工具，并进而通过人源化、单链化等分子改造得到药学性质更为优良的抗体分子，尤其是提供一种人乙型肝炎病毒X蛋白的单克隆抗体及用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供能够特异性识别多种亚型HBx蛋白的单克隆抗体，具体涉及一种人乙型肝炎病毒X蛋白的单克隆抗体，包括其轻链和重链可变区及互补决定区的氨基酸序列和核苷酸序列，为构建性质更优的人源化抗体、单链抗体等基因工程抗体提供支持。本专利技术的另一目的是提供检测多种亚型HBx蛋白及其相应抗体的方法。本专利技术通过以下技术方案实现：能够识别除G型以外7种亚型HBV编码的HBx蛋白的单克隆抗体，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区中的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为：CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr；CDR2：Asp Pro Ser Asn Ser Glu；CDR3：Asp Gly Ala Tyr；所述轻链可变区中的3个CDR氨基酸序列分别为：CDR1：Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His；CDR2：Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser；CDR3：Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr。所述的HBx蛋白单克隆抗体，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示。所述的HBx蛋白单克隆抗体，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本专利技术还提供了一种杂交瘤细胞株，命名为Anti-HBx KY01，已于2014年4月2日保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面))，其保藏编号为CCTCC NO：C201446，所述细胞株能够分泌产生所述的HBx蛋白单克隆抗体。本专利技术中，根据所述的HBx蛋白单克隆抗体CDR序列，通过基因工程方法构建的相应的单链抗体、人(鼠)嵌合抗体或人源化抗体。本专利技术还提供所述的HBx蛋白单克隆抗体在用于检测人乙型肝炎病毒X蛋白中的应用。本专利技术还提供所述的HBx蛋白单克隆抗体在制备治疗人乙型肝炎病毒感染及与之相关肝脏疾病的药物中的应用。目前公开文献中虽有关于HBx单克隆抗体制备和应用的报道，市场上亦有仅限于研究应用的HBx单克隆或多克隆抗体在售，但上述HBx抗体均缺乏针对不同亚型HBx反应性的公开、有效数据，其中的单克隆抗体亦未公开其氨基酸及核苷酸编码序列，无法进行进一步的基因工程改造。本专利技术提供了针对HBx的小鼠单克隆抗体KY01能够特异性识别HBV已知8个基因型中除G型外的7个常见基因型编码的HBx蛋白；所述KY01能够在Western blot检测中识别变性的HBx蛋白，能够在ELISA检测中识别未变性的HBx蛋白，能够在免疫荧光检测中识别细胞内的天然形式HBx蛋白；不仅如此，KY01还能够在免疫组化法中检测到HBV相关肝癌病人癌细胞中的HBx抗原；实验显示KY01在临床样本中HBx蛋白及其抗体检测中具有广泛的应用价值，可用于针对HBx蛋白的诊断和治疗方法的研发。本专利技术还公开了KY01的重链和轻链可变区序列，为通过基因工程方法改造KY01获得具有更优特性的重组抗体用于诊断和治疗建立了基础。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：1、本专利技术提供的HBx单克隆抗体(命名为KY01)，在免疫印迹和免疫荧光检测方法中可特异性识别已知8种HBV基因型中除G型以外的7种基因型(A-F及H型)所编码的HBx蛋白，所述抗体特异性地与HBx蛋白第61-120位氨基酸区段特异结合，与HBx蛋白其它部位、HBV其它蛋白、Flag和人蛋白组无特异性反应。2、本专利技术克隆并测定了HBx单克隆抗体KY01的轻链可变区和重链可变区的基因序列及对应的氨基酸序列，证实其序列唯一性。3、通过分析KY01的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列，得到了轻链和重链互补决定区CDR1-3的氨基酸序列，为构建具有更优药学及其它特性的基因工程抗体提供支持。附图说明图1，Anti-HBx KY01杂交瘤细胞培养上清纯化得到的单克隆抗体KY01的纯度鉴定和滴度检测结果，其中显示，A：纯化的单克隆抗体KY01经还原性SDS-PAGE电泳(分离胶浓度12％)后，考马斯蓝染色，两条主要条带分别为抗体重链(高分子量条带)和轻链(低分子量条带)；B：96孔板中包被原核表达的HBx抗原并以脱脂奶粉封闭后，加入梯度稀释的纯化单克隆抗体KY01孵育，以ELISA方法确定纯化抗体的滴度为1：2500000。阳性阈值设置为0.3(横线显示)。图2，单克隆抗体KY01在Western blot检测中对8个基因型(A-H)H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗人乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：a)所述重链可变区中的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为：CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr；CDR2：Asp Pro Ser Asn Ser Glu；CDR3：Asp Gly Ala Tyr；和b)所述轻链可变区中的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为：CDR1：Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His；CDR2：Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser；CDR3：Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr。
【技术特征摘要】
1.一种抗人乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：a)所述重链可变区中的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为：CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr；CDR2：Asp Pro Ser Asn Ser Glu；CDR3：Asp Gly Ala Tyr；和b)所述轻链可变区中的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为：CDR1：Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His；CDR2：Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser；CDR3：Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr。2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：其中，a)编码重链可变区的基因序列如SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢幼华，刘晶，魏丽丽，沈忠良，潘少坤，
申请(专利权)人：复旦大学，上海科垣生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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