本发明专利技术涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。所述菌剂制备方法包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）固体发酵培养时；（4）菌剂制备，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。本发明专利技术以巨大芽孢杆菌T317为出发菌株，对其固氮酶活性以及分泌生长素能力进行测定，发现菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800‑900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300‑400mg/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物菌剂
，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法。
技术介绍
农业生产长期过分依赖化学肥料和农药，已经造成了农田土质和肥力下降，农作物品质降低，食品和地下水等环境污染也日趋严重。随着生态农业和绿色食品生产的兴起和发展，加之我国大多数土壤中速效磷、钾及其他一些养分的缺乏，微生物肥料作为生物技术发展和农业生产的一类重要肥源逐渐引起了人们的关注。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是一种好氧产孢革兰氏阳性细菌，至今已有一百多年的研究历史。近年来，随着微生物肥料的研究，巨大芽孢杆菌作为解磷菌被广泛应用于解磷细菌肥料生产。目前，国内对巨大芽孢杆菌在微生物肥料上的研究主要集中在菌株选育、解磷效果、发酵条件优化及与解钾菌相互作用等方面，而对巨大芽孢杆菌的固氮作用却不多见。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317，其具有固氮酶活性和分泌生长素吲哚乙酸的功能。本专利技术的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317菌剂，该具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。本专利技术的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种巨大芽孢杆菌T317，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Collection)，地址为中国武汉大学，分类命名为巨大芽孢杆菌 T317 Bacillus megaterium T317，保藏号为CCTCCM 2015753，保藏日期：2015年12月15日。所述巨大芽孢杆菌T317具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。固氮酶活性测定1、试验方法采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5mL半固体培养基的10mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24h后，注入1/10体积的10％乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小(北京农业大学微生物专业编，1986)：C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t) (2.1)其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(mL·h)]。2、试验结果结合公式(2.1)和固氮酶活性测定图4得知，固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)。由此可以说明，巨大芽孢杆菌T317在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。生长素定性含量测定(1)挑取菌株分别接种(OD600＝1.0，0.5mL菌悬液)到盛有50mL King液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。(2)接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。(3)将上述在King液体培养基上生长3d的菌悬液50μL置于透明离心管中，同时加50μL比色液。(4)设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50μL浓度为10mg/L的植物生长激素(IAA)，同时加50μL比色液。阴性对照中加50μLKing液体培养基，同时加50μL比色液。(5)将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。培养基为King培养基(1L)；试剂配方为：蛋白胨20g，K2HPO4 1.725g，MgSO4·7H2O 1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。生长素定量测定参照Riberio等的方法略加改动。菌株T317接种到含有1g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，振荡培养48h。将培养液10000r/min离心5min，取100mL上清液加到96孔板中，与100mL Salkowski’s试剂(1mL 0.5mol/L FeCl3和49mL 35％ 高氯酸)混匀，室温静置30min，在波长530nm下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的IAA标准品制作标准曲线，测定结果见表1。表1 菌株T317 IAA测定结果从表1和图5可以看出，巨大芽孢杆菌T317的生长素浓度(分泌量)为312.48mg/L，因此，可以判断巨大芽孢杆菌T317在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，包括以下步骤：(1)分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；(2)纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；巨大芽孢杆菌T317单菌落如图1所示。具体地，在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。(3)固体发酵培养选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0％，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时。(4)菌剂制备将发酵后产物于50℃烘干后用小型粉碎机打碎，设定最终产品活菌数为5亿/g，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/g以上，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。固体发酵培养中固体培养基的配方优化实验(3.1)菌种由实验室自行分离，经鉴定为芽孢杆菌属中的Bacillus megaterium，编号为T317。(3.2)固体培养基为培养基一：LB培养基(Lysogeny Broth，即溶菌肉汤培养基，是培养细菌最基础最常见的培养基)；培养基二：种子培养基配方(g/L)：淀粉16，酵母抽提粉4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，培养基二的pH为7.0；培养基三：发酵培养基配方(g/L)：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO30.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5，培养基三的pH为7.0。上述发酵培养基配方一和三的缺陷是发酵成本高，不适宜生产。培养基二的种子培养基配方发酵用量少，发酵效果好。(3.3)固体发酵产孢条件的单因素试验①淀粉原料对产孢量的影响：选用小麦粉、面粉和麸皮为淀粉原料，按照豆粕∶淀粉原料本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。
【技术特征摘要】
1.一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。2.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317具有序列表NO.1的DNA序列。3.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。4.权利要求1-3任意一项所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；（3）固体发酵培养选取上述巨大芽孢杆菌T317单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0%，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时；（4）菌剂制备将发酵后产物烘干后打碎，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。5.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮65-75份，豆粕20-28份，NaCl 4-5份，CaCO3 1-2份，MnSO4·H2O 0.01-0.05份，MgSO4·7H2O 0.03-0.08份，培养基的pH为7.1-7.4。6.根据权利要求5所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈世华，杨国平，林敏，孙旭生，王亚君，尹坤，杨盼盼，张学贤，陈三凤，谭志远，燕永亮，
申请(专利权)人：东莞市保得生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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