具有经修饰的CH2-CH3序列的犬抗体制造技术

本发明专利技术公开了具有特定属性的犬化抗体。本发明专利技术也公开了针对犬PD‑1的犬化鼠类抗体，其对犬PD‑1具有高结合亲和力。本发明专利技术还公开了本发明专利技术的犬化抗体在治疗狗的癌症上的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求享有于2014年7月30日提交的美国临时申请系列号62/030,812、于2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,847和于2014年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,946的权益，上述所有文件的内容通过引用以其整体并入本文。专利
本专利技术涉及具有特定属性的犬化抗体。本专利技术也涉及针对犬PD-1的犬化抗体，其具有特定序列并对犬PD-1具有高结合亲和力。本专利技术还涉及本专利技术的抗体在治疗狗（包括癌症治疗）上的用途。专利技术背景犬抗体（也称为免疫球蛋白G或IgG）是约150 Kd的大四聚体蛋白质。每个IgG蛋白质由两条相同的、各约25 Kd的轻链和两条相同的、各约50 Kd的重链构成。犬IgG有四个已知的IgG重链亚类，且其分别被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD表示。轻链有两个类型：κ和λ链。每一条κ 或λ 轻链均由一个可变域（VL）和一个恒定域（CL）构成。两条重链中的每一条均由一个可变域（VH）和三个恒定域（称为CH-1、CH-2和CH-3）组成。CH-1域通过称为“铰链”或作为另一种叫法“铰链区”的氨基酸序列连接至CH-2域。在人类中，IgG以四个被称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类中的一类而存在。IgG的亚类很大程度上由铰链区的序列所确定，该序列在IgG的四个亚类中彼此不同。两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链也通过二硫键连接至轻链中的一条。用木瓜蛋白酶消化IgG抗体使抗体分子在铰链区断裂而导致形成三个片段。这些片段中的两个是相同的并且各自由与重链的VH和CH1域维系在一起的轻链组成。这些片段被称为“Fab”片段，并且其含有抗体的抗原结合位点。用木瓜蛋白酶消化所得的第三个片段被称为“Fc”，并且其含有通过二硫键维系在一起的两条重链的剩余部分。Fc因而含有由两条重链各自的CH2和CH3域所组成的二聚体。Fab使得抗体能够结合其同源表位，而Fc使得抗体能够介导免疫效应器功能如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。本领域熟知，IgG抗体通过使其Fc部分结合至一族被称为Fcγ受体的蛋白质来介导效应器功能如ADCC和ADCP，而CDC则是通过使Fc结合至补体的第一组分，C1q，来介导的。本领域还熟知，不同的IgG亚类在其介导这些效应器功能的能力上有所不同。例如，人类IgG1显示出强ADCC和CDC，而IgG4则显示出弱乃至无ADCC和CDC。另外，用于识别哪个IgG亚类显示出或缺乏效应器功能的方法是本领域熟知的。用于治疗目的的依赖单克隆抗体的方法需要设计相称的抗体或抗体片段以实现所需的治疗响应。例如，一些癌症治疗方法需要治疗抗体具有增强的效应器功能，而其它的则需要显著减少或完全消除效应器功能。效应器功能的增强或消除可以通过如下实现：在抗体的Fc部分引入一个或多个氨基酸突变（置换），从而增强或减少对Fcγ受体以及补体的第一组分的结合。现有技术中有许多的报道描述了可被引入抗体分子从而调节其效应器功能的氨基酸置换。例如，Shields 等人, [J.of Biol.Chem., 276 (9):6591-6604 (2001)]公开了将天冬酰胺置换为丙氨酸（N297A），其导致非糖基化的抗体，显著减少了抗体对若干Fcγ受体的结合。另外，Shields 等人公开了将天冬氨酸置换为丙氨酸（D265A）也显著减少了抗体对Fcγ受体的结合。N297A和D265A置换也各自显示出显著地损害CDC。还有其它类似的报道也识别出了可能减少或消除抗体的效应器功能的置换[例如，Sazinsky 等人， Proc.Nat.Acad.Sci., 105:20167-20172 (2008), Alegre 等人, Transplantation,57:1537-1543(1994),Hutchins等人,Proc.Nat.Acad.Sci.92:11980-11984 (1994), McEarchem 等人, Blood,109:1185-1192 (2007)]。主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体（程序性细胞死亡受体1，也被称作程序性死亡受体（PD-1））是与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似的家族成员是含有细胞外Ig可变型（V-型）结构域（其结合它的配体）和胞质尾区（其结合信号传递分子）的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：ITIM（基于免疫受体酪氨酸的抑制基序）和ITSM（基于免疫受体酪氨酸的转换基序）。PD-1当结合至程序性细胞死亡配体1（也被称作程序性死亡配体1（PD-L1））和/或程序性细胞死亡配体2（也被称作程序性死亡配体2（PD-L2））时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合会负调节抗原受体信号传递。阻断PD-L1与PD-1的结合会增强肿瘤特异性的CD8+ T-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠PD-1的三维结构、以及小鼠PD-1与人PD-L1的共晶结构[Zhang 等人,Immunity 20: 337-347 (2004); Lin 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-3016 (2008)] 。PD-L1和PD-L2是含有在细胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传递基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2二者组成性地表达，或者可以在多种细胞类型（包括非造血组织以及多种肿瘤类型）中诱导。PD-L1不仅在B、T、骨髓和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞（诸如微血管内皮细胞和非淋巴样器官例如心脏或肺）上表达。相反，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自体反应性T-和B-细胞应答。在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1在至少某些人癌症中起关键作用，可能是通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被证实在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFN-γ诱导[Iwai 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297 (2002); Strome 等人, Cancer Res., 63:6501-6505 (2003)] 。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴别出PD-1在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[Brown 等人, J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong 等人,Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle 等人,Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome 等人,Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)本文档来自技高网...

【技术保护点】
犬可结晶片段区（cFc区），其包含选自SEQ ID NO: 130和SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；其中在指定位置的一至七个氨基酸残基被置换，所述指定位置选自P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/918946;2013.12.20 US 61/918847;201.犬可结晶片段区（cFc区），其包含选自SEQ ID NO: 130和SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；其中在指定位置的一至七个氨基酸残基被置换，所述指定位置选自P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。2.根据权利要求1的Fc区，其中所述被置换的一至七个氨基酸残基的所述置换选自P4A、D31A、N63A、G64A、T65A、A93G和P95A。3.犬化抗体，其包含根据权利要求1或2的cFc区。4.根据权利要求3的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬化抗体特异性结合犬程序性死亡受体1（犬PD-1）。5.根据权利要求4的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112的氨基酸序列。6.根据权利要求4或5的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含重链互补决定区1（VH CDR1）、重链互补决定区2（VH CDR2）和重链互补决定区3（VH CDR3），所述重链互补决定区1包含选自SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列；所述重链互补决定区2包含选自SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35的氨基酸序列；所述重链互补决定区3包含选自SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。7.根据权利要求4、5或6的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含轻链互补决定区1（VL CDR1）、轻链互补决定区2（VL CDR2）和轻链互补决定区3（VL CDR3），所述轻链互补决定区1包含选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列；所述轻链互补决定区2包含选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；所述轻链互补决定区3包含选自SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。8.根据权利要求3的犬化抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 66的氨基酸序列；其中所述犬化抗体包含cFc区，所述cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO: 132的氨基酸序列，其中在所述cFc区的指定位置处，七个氨基酸残基中的至少一个被不同的氨基酸残基所替换，所述七个氨基酸残基选自SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO: 132的P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。9.根据权利要求8的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含犬轻链，所述犬轻链包含选自SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 102和SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。10.具有铰链区的犬可结晶片段区（cFc区）；其中所述cFc区和铰链区包含选自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。11.犬化抗体，其包含根据权利要求10的cFc区和铰链区。12.根据权利要求11的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬化抗体特异性结合犬程序性死亡受体1（犬...

【专利技术属性】
技术研发人员：M莫塞，张远征，I塔佩伊，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL