本发明专利技术公开了一种测定血浆中5，2`‑二羟基，6，7，8，5`‑四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶剂进行药物液液提取，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中skullcapflavone‑II的浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种测定血浆中5，2`-二羟基，6，7，8，5`-四甲氧基黄酮(skullcapflavone II)浓度的方法。
技术介绍
Skullcapflavone-II，即5，2`-二羟基，6，7，8，5`-四甲氧基黄酮，是从药用植物黄芩中分离得到的黄酮类新化合物。SKullcapflavone-II具有对抗炎症、病毒和免疫调节的作用。此外，许多成分有止痒、调节代谢紊乱、神经保护、促进血管新生、抗癌和抗HIV的作用。Skullcapflavone-II具有多种生物学特性，如细胞毒性的假定作用，对肥大细胞组胺释放的影响，通过胰蛋白酶抑制纤溶酶原激活物1型升高抑制剂和抗哮喘气道炎症反应。其结构式如下：目前尚未关于Skullcapflavone-II体内测定方法的文献报道。本专利技术建立了Skullcapflavone-II在beagle犬体内的测定方法，通过该方法对Skullcapflavone-II的药物代谢情况进行探索性研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种测定血浆中skullcapflavone-II浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标新补骨脂异黄酮，加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取，取上清液在40℃氮气吹干后，用流动相溶解后进样分析；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相：体积比为80∶20的乙腈与水；流速：0.2mL·min-1； 柱温：40℃；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas1：70psi；离子源Gas2：80psi；脱溶剂温度：400℃；CXP：9V；碰撞气CAD：10V；DP：100V；EP：10V。检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1(4)计算：采用内标法，以skullcapflavone-II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone-II的浓度。具体地，步骤(1)中，取血浆样品500μL，加入100ng·mL-1内标新补骨脂异黄酮20μL，加入4mL乙酸乙酯，震荡3min后3500×g离心10min，取上清液3.5mL在40℃氮气吹干后，用100μL流动相溶解后，10μL进样分析。步骤(2)中，色谱柱长度为150mm，内径为2.1mm，填料粒径为5μm。其中，所述的血浆为给予了含skullcapflavone-II药物的血浆。在一个具体的实施方案中，所述血浆为人或动物的血浆。在一个具体的实施方案中，所述血浆为犬血浆。所述的犬为beagle犬。有益效果：本专利技术方法与现有技术相比具有如下优势：(1)预处理方法简便：使用有机溶剂液页萃取法，适用于常规测定。(2)专属性强：采用Agilem ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相，乙腈和水的混合液作为流动相，等度洗脱，Skullcapflavone-II保留时间为3.09min左右，内标新补骨脂异黄酮保留时间为2.88min左右，4.5min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1ng·mL-1。(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为Skullcapflavone-II的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1～4000ng·mL-1，日内和日间精密度RSD均小于10％。附图说明图1为犬空白血浆的质谱图；图2为犬空白血浆加入Skullcapflavone-II和内标对照品的质谱图；图3为犬给予Skullcapflavone-II后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图；注：图中离子通道1为Skullcapflavone-II，[M-H]+，m/z 375.1→345.1，保留时间为3.09min左右；离子选择通道2为内标新补骨脂异黄酮，[M-H]+，m/z 323.3→255.1，保留时间为2.88min左右。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例：犬血浆中Skullcapflavone-II浓度的测定一、实验材料与仪器skullcapflavone-II：由泽朗医药集团提供(南京，中国)；新补骨脂异黄酮(内标)：购于国家药品生物制品检定所购买(北京，中国)；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(Merck Company)。Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.，5μm，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA)；API4000 LC-MS/MS三重四级杆质谱仪(美国AB有限公司)，色谱工作站为Analyst 1.4.2；CPA225D电子分析天平(德国赛多利斯有限公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；Milli-Q系统纯水机(微孔，贝德福德，MA，USA)；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。二、液质条件 1.液相色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150mm×2.1mm I.D.，5μm，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA)；流动相：乙腈和水溶液(80∶20，v/v)；流速：0.2mL·min-1；柱温：40℃。2.质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；Curtain gas：20；Gasl：70；Gas2：80；脱溶剂温度：400℃；CXP：9；CAD：10；DP：100；EP：10。检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1。三、实验过程：1.Skullcapflavone-II标准溶液的配制：精密称取Skullcapflavone-II 10.08mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.008mg·mL-1Skullcapflavone-II的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释，配成浓度分别为1，5，10，50，100，500，1000，4000ng·mL-1的Skullcapflavone-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标新补骨脂异黄酮，加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取，取上清液氮气吹干后，用流动相溶解得到预处理后的血浆样品；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中，色谱柱为Agilent ZORBAX SB‑C18柱；流动相为体积比为80∶20的乙腈与水；流速为0.2‑0.5mL·min‑1；柱温为40℃；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone‑II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas1：70psi；离子源Gas2：80psi；脱溶剂温度：400℃；CXP：9V；CAD：10V；DP：100V；EP：10V，检测对象的离子通道：skullcapflavone‑II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3→255.1(4)计算：采用内标法，以skullcapflavone‑II和内标新补骨脂异黄酮的峰面积比值代入标准曲线方程计算skullcapflavone‑II的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中skullcapflavone II浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标新补骨脂异黄酮，加入一定量的乙酸乙酯进行有机溶剂萃取，取上清液氮气吹干后，用流动相溶解得到预处理后的血浆样品；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相为体积比为80∶20的乙腈与水；流速为0.2-0.5mL·min-1；柱温为40℃；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；skullcapflavone-II碰撞电压23eV；内标新补骨脂异黄酮碰撞电压29eV；毛细管电压4.5kV；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas1：70psi；离子源Gas2：80psi；脱溶剂温度：400℃；CXP：9V；CAD：10V；DP：100V；EP：10V，检测对象的离子通道：skullcapflavone-II m/z 375.1→345.1，内标新补骨脂异黄酮m/z 323.3...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘史佳，张农山，戴国梁，居文政，储继红，李长印，许美娟，吴婷，张军，冯丽雯，
申请(专利权)人：江苏省中医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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