一种制备聚乙二醇化蛋白的组合物的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质聚乙二醇化的领域。具体地，本发明专利技术涉及用于聚乙二醇化治疗性蛋白质的方法。本发明专利技术还涉及这样的聚乙二醇化治疗性多肽用于治疗肌肉疾病和疾患的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是蛋白质聚乙二醇化的领域。特别是，本专利技术涉及聚乙二醇化的治疗性蛋白质，如聚乙二醇化的IGF-1多肽和其变体。
技术介绍
使用聚乙二醇(PEG)共价修饰蛋白质已被证明是延长蛋白质在体内循环半衰期的有效方法(Hershfield,M.S.,等人,N.Engl.J.Med.316(1987)589-596；Meyers,F.J.等人,Clin.Pharmacol.Ther.49(1991)307-313；Delgado,C等人,Crit.Rev.Ther.Drug)。这个方法被称为聚乙二醇化，其是最成熟的、并成功地用于改善药学活性蛋白质的治疗价值的技术(Roberts等人,Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476；Caliceti P.等人,2003)。PEG链附着到蛋白质增加其分子量和流体动力学半径，导致显著的体内半衰期延长。缠绕蛋白质的PEG链对蛋白质具有屏蔽作用，因而降低蛋白水解降解和缀合物的免疫原性。聚乙二醇化也改变生物分布特性和显著增加疏水性蛋白质的溶解度(Caliceti,P.和Veronese,F.M.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.,55,1261.,Roberts等人,Chemistry for peptide and protein PEGylation.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54 459-476；)。通过使用甲氧基聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimmidyl)(PEG-NHS)实现的偶联化学作用，可以导致在不同赖氨酸残基上缀合，形成位置亚型和多聚乙二醇化形式的复杂混合物。在治疗中已经被使用数年的几种缀合物是随机聚乙二醇化化学作用的结果。随机聚乙二醇化的主要缺点是缺少最终产品的同质性。因此可预期反应再现性的困难和最终产品的分析表征中的挑战。胰岛素样生长因子(IGF)是一个复杂系统的一部分，其中细胞使用其与其生理环境联系。这种复杂系统(通常被称为胰岛素样生长因子轴)由两个细胞表面受体(IGF-1R和IGF-2R)、两个配体(IGF-1和IGF-2)、六个高亲和性IGF结合蛋白(IGFBP 1-6)的家族、以及相关的IGFBP降解酶(蛋白酶)组成。这个系统不仅对正常生理的调节是非常重要的，也对一些病理状态是非常重要的(Glass,Nat Cell Biol 5:87-90,2003)。IGF轴已被证明在促进细胞增殖和抑制细胞死亡(细胞凋亡)中发挥作用。IGF-1主要由人生长激素(hGH)刺激肝脏后分泌。几乎在人体内的每个细胞均受IGF-1影响，特别是肌肉、软骨、骨、肝、肾、神经、皮肤和肺中的细胞。除了胰岛素样作用外，IGF-1也能调节细胞生长。IGF-1和IGF-2由称为IGF结合蛋白的基因产物家族调节。这些蛋白质以复杂的方式帮助调节IGF活性，包括通过防止结合到IGF受体而抑制IGF活性。人IGF-1，也被称为生长调节素的成熟形式，是70个氨基酸的小蛋白质，已经表明其刺激培养中多种细胞的生长。IGF-1蛋白最初由三个已知的剪接变体mRNA编码。各mRNA的开放阅读框编码含有70个氨基酸的IGF-1(SEQ ID NO：1)和在C-末端的特定的E-肽(这取决于特定的IGF-1mRNA)的前体蛋白。这些E-肽被称为Ea(rsvraqrhtdmpktq.kevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：2)，Eb(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk；SEQ ID NO：3)和Ec(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk；SEQ ID NO：4)肽，长度范围35至87个氨基酸，并且包含N-末端的共同序列区和C末端的可变序列区。例如，IGF-1-Ea的野生型开放阅读框编码135个氨基酸的多肽，其包括前导序列和无前导序列的105个氨基酸的多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm；SEQ ID NO：5)。在生理表达时，E-肽通过内源性蛋白酶从前体裂解以产生成熟的70个氨基酸的IGF-1。在人血清中IGF-1的可用性和半衰期主要受蛋白酶和IGF-1结合蛋白(IGFBP’s)的影响和调节。IGFBP’s既可以抑制又可以加强IGF-1活性(Oh Y,等人,Characterization of the affinities of insulin-like growth factor(IGF)-binding proteins 1-4for IGF-I,IGF-II,IGF-I/insulin hybrid,and IGF-I analogs.Endocrinology.1993Mar；132(3):1337-44)。增加IGF-1半衰期的策略已经在现有技术中描述。已考虑的策略是：(ⅰ)生成含有特异性突变的IGF-1变体，旨在防止在人血清中通过丝氨酸蛋白酶裂解IGF-1，或者减轻IGF-1结合蛋白对IGF-1可用性或血清半衰期的负面影响(WO200040613，WO05033134，WO2006074390，WO2007146689)；(ⅱ)生成IGF-1融合蛋白，其中成熟的IGF-1蛋白融合到人免疫球蛋白Fc区(WO2005033134，WO200040613)；(iii)使用IGF-1前体蛋白，其中通过修饰前体蛋白降低蛋白酶导致的E-肽从IGF-1的裂解(WO2007146689)；(ⅳ)组合上述策略((ⅰ)/(ⅱ)WO05033134，(ⅰ)/(ⅱ)WO200040613，(ⅰ)/(ⅲ)WO2007146689)，以及(v)生成聚乙二醇化的IGF-1变体(WO2009121759，WO2008025528和WO2006066891)。因为IGF-1具有差的药物动力学性质(短的消除半衰期)，制备IGF变体的聚乙二醇化版本。制备IGF变体的聚乙二醇化版本用于治疗神经肌肉病患在WO2008025528，WO2009121759A2和WO2006066891中描述。通常PEG连接于蛋白质的氨基。然而，这种氨基聚乙二醇化方法的主要限制是，蛋白质通常含有大量的赖氨酸残基，因此，聚(乙二醇)基团以非特异性的方式连接于蛋白质。生物活性所需氨基残基(例如蛋白质活性位点附近或活性位点上的残基)的聚乙二醇化可以导致低的比活性或蛋白质的失活。为了避免上述的一些缺点，WO2006066891描述了使用由IGF-1变体和一个或两个聚(乙二醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物的方法，其中，在所述组合物中至少61％包含于所述组合物中的单聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N‑端单聚乙二醇化治疗性蛋白质，所述方法包括在水性介质中使治疗性蛋白质与水溶性聚乙二醇在还原性烷基化条件下反应的步骤，其特征在于所述反应在pH范围约6.5至7.5进行，以提供聚乙二醇化治疗性蛋白质组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.12 US 61/915,0901.一种用于制备聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物的方法，其中，在所述组合物中至少61％包含于所述组合物中的单聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质，所述方法包括在水性介质中使治疗性蛋白质与水溶性聚乙二醇在还原性烷基化条件下反应的步骤，其特征在于所述反应在pH范围约6.5至7.5进行，以提供聚乙二醇化治疗性蛋白质组合物。2.一种用于制备单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物的方法，其中在所述组合物中至少65％包含在所述组合物中的单聚乙二醇化蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质，所述方法包括步骤(a)在水性介质中使治疗性蛋白质与水溶性聚乙二醇在还原性烷基化条件下反应，其特征在于偶联反应在pH范围约6.5至7.5进行，(b)对在步骤(a)中获得的组合物进行层析步骤，以提供单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物。3.根据权利要求1-2任一项所述的制备组合物方法，其中所述治疗性蛋白质是人IGF-1前体蛋白或其变体。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于在α环糊精(α-CD)存在下进行聚乙二醇化反应。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于PEG具有20至100kDa的总分子量。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于PEG具有约30kDa的总分子量。7.根据权利要求2-6所述的方法，其中交换层析步骤为阳离子交换层析(CEX)步骤，其包括合并含有N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质的那些级分，以提供单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物。8.根据权利要求7所述的方法，还包括以下附加的步骤b)超滤(UF)/渗滤(DF)浓缩和缓冲液交换，c)最后的过滤。9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其中IGF1前体蛋白是人IGF-1Ea肽前体蛋白，其中氨基酸E3缺失，氨基酸R37被丙氨酸取代和氨基酸R71和S72缺失，和其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO：5。10.根据权利要求9所述的方法，其中IGF1前体蛋白是由SEQ ID NO：55组成的人IGF-1Ea肽前体蛋白。11.根据权利要求1、3-6、9和10的方法生产的组合物，其中在所述组合物中至少61％包含在所述组合物中的单聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质。12.根据权利要求2-10的方法生产的单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物，其中在所述组合物中至少65％包含在所述组合物中的治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质。13.根据权利要求1、3-6、9和10的方法获得的聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物，其中在所述组合物中至少61％包含在所述组合物中的单聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质。14.根据权利要求2-10的方法获得的单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物，其中在所述组合物中至少65％包含在所述组合物中的聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质。15.根据权利要求1、3-6、9和10的方法获得的聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物，其中在所述组合物中至少61％包含在所述组合物中的单聚乙二醇化治疗性蛋白质级分是N-端单聚乙二醇化治疗性蛋白质。16.根据权利要求2-10的方法获得的单聚乙二醇化治疗性蛋白质的组合物，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·叶夫谢瓦尔，M·昆斯特尔，B·波多布尼克，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，斯洛文尼亚莱柯制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH