一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用。本发明专利技术采用反相悬浮交联法，通过戊二醛交联，与壳聚糖分子聚合制备了磁性Fe3O4/CTS微球，并优化了磁性Fe3O4/CTS微球固定化失活Candida.u CICC1769细胞的工艺参数，从而利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素，不仅获得了吸附效果好、成本低、绿色环保的优点，也可实现失活酵母细胞与目标产品的高效快速分离，同时避免了活体微生物对产品和人体产生的诸多不利影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全
，具体而言，涉及一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用。
技术介绍
PAT(patulin，PAT)，又名棒曲霉素，是一种半缩醛内酯，分子式为C7H6O4，化学名称为4-羟基-4-氢-呋喃-[3,2碳]-吡喃-2(6氢)酮。PAT具有急性毒性，包括对动物的肺、脑水肿、肝脏、脾脏、肾的损害和免疫系统的毒害作用；也具有慢性毒性，表现在对动物的细胞毒性，基因毒性和免疫毒性。对巯基有强亲和力，可与含巯基的蛋白和多肽反应，破坏DNA单链和双链，从而抑制DNA和RNA的合成，也可抑制多种酶活性，特别是一些生化指标中的酶，如碱性磷酸酶、二磷酸果糖酶和己糖激酶等。此外，PAT对成年哺乳动物和胚胎期动物的肾脏也有毒害作用。直接接触皮肤，可引起DNA损伤，从而造成细胞周期阻滞和内部介导细胞凋亡，积累大量具有皮肤毒性的聚胺产物。PAT是水果中常见的真菌毒素，在霉烂的杏、李、桃、梨、香蕉、菠萝、青梅、蜜瓜、蕃茄、樱桃、辣椒、葡萄、柿子、黄瓜、胡萝卜、蕃茄酱、苹果汁、苹果酱、葡萄汁、苹果制品、谷物、糕点及豆科植物、陈的火腿、干香肠等食品中均有发现。目前，世界上已经有很多国家制定了水果及其制品中PAT的最高限量标准。1995年，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)将PAT的每天容许摄入量定为0.4μg/kg bw。在欧洲，由欧洲卫生与消费者保护委员会发起的一项科学研究表明，PAT每日允许摄入量要远远低于JECFA设定的水平。我国规定在苹果和山楂制品中限量值为50μg/kg。目前，国内外对柑橘属中PAT的限量标准属于空白，亟待针对不同柑橘种类、不同食用方式等进行相关PAT限量标准的研究和完善。为了降低食品中PAT的含量，人们尝试了很多控制方法，比较传统的方法主要可归纳为物理法和化学法。物理方法如加强原料的挑选和清洗、物理吸附和澄清等，但是这种方法耗时又费力，而且据报道PAT可以从腐烂部位渗透至未腐烂部位，在完整的水果部位仍然可以检测到PAT。另外，清洗会使PAT进入清洗用水中造成清洗容器、工具及环境的二次污染。再者，在果汁加工过程中使用活性炭进行吸附，但活性炭也
严重影响了果汁的颜色并且大大降低了总酚含量。化学方法主要为使用添加剂或化学杀菌剂等手段降低PAT的含量，但是这些添加剂只能抑制PAT产生菌的生长和产毒，不能够直接去除食品中已经含有的PAT。生物吸附是利用微生物细胞上的化学键与展青霉素结合，产生吸附或者降解的作用，该类方法吸附效果好、成本低、绿色环保、不会产生二次污染、不会破坏食品的营养价值。国内外关于微生物对展青霉素的去除作用的研究主要集中在具有展青霉素去除作用微生物的筛选和影响展青霉素去除效果因素的研究。现有研究表明，展青霉素在一些活体微生物发酵过程中几乎可以全部消失，然而活体微生物对果汁类产品和人体健康必然产生一定的影响，因此其使用受到了限制。另外，由于微生物细胞个体微小，在吸附展青霉素之后，从果汁类产品中进行完全分离和去除时存在较大困难，进一步限制了游离活体生物吸附法在果汁生产中的实际应用。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于通过大量试验筛选出显著吸附展青霉素的失活微生物，从而提供一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用，可实现失活酵母细胞快速分离与聚集，同时避免了活体微生物对产品和人体产生的诸多不利影响。为了实现本专利技术的目的，专利技术人利用多年的科研实践经验，并结合大量试验研究，优选出灭活后能在柑橘汁中高效去除展青霉素的微生物菌株，从而实现了本专利技术的目的。具体地，本专利技术的技术方案概况如下：一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22～-18℃下的预冷8-16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56～-52℃，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；(2)Fe3O4磁性纳米粒子的制备：按摩尔比(1.6-2.0)：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的容器中，加入盐酸和PEG-2000，控制温度33-36℃，搅拌并N2保护条件下，快速加入氨水，
滴加至pH为9-9.5，搅拌10-30min后于水浴恒温70℃熟化20-40min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子，备用；(3)磁性Fe3O4/CTS微球的制备：称取Fe3O4磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5％的乙酸溶液，Fe3O4磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span-80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2-4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe3O4/CTS微球，备用；(4)固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀10-15h后，加入步骤(1)制备的失活酵母菌粉，调pH＝6，25-35℃下固定化反应1.5-3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞；(5)将固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球加入柑橘汁中，置于10-20℃下震荡或搅拌处理10～20h，处理结束后进行磁性分离，得去除展青霉素的柑橘汁。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(1)的技术参数为：预冷温度-20℃，预冷时间12h，冷冻温度-54℃，真空度5mtorr，干燥时间26h。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与液体石蜡的质量比为1：(150-300)。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与span-80的质量比为1：(2-4)。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与戊二醛的质量比为1：(3-5)。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(4)中磁性Fe3O4/CTS微球与失活酵母菌粉的质量比为(7-9)：1。优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其其中步骤(5)中固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为1000～5000:1。另外，由于上述磁性微球固定化失活酵母细胞利用其细胞上的化学键与展青霉素结合，产生吸附或/和交联的作用，从而可以高效去除柑橘汁中展青霉素，因此本专利技术
还提供了上述失活酵母细胞菌株的新应用，即：失活酵母细胞在制备柑橘汁中展青霉素吸附剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在‑22～‑18℃下的预冷8‑16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为‑56～‑52℃，真空度4‑6mtorr，时间20‑30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；(2)Fe3O4磁性纳米粒子的制备：按摩尔比(1.6‑2.0)：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的容器中，加入盐酸和PEG‑2000，控制温度33‑36℃，搅拌并N2保护条件下，快速加入氨水，滴加至pH为9‑9.5，搅拌10‑30min后于水浴恒温70℃熟化20‑40min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子，备用；(3)磁性Fe3O4/CTS微球的制备：称取Fe3O4磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5％的乙酸溶液，Fe3O4磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span‑80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2‑4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe3O4/CTS微球，备用；(4)固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀10‑15h后，加入步骤(1)制备的失活酵母菌粉，调pH＝6，25‑35℃下固定化反应1.5‑3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞；(5)将固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769细胞的磁性微球加入柑橘汁中，置于10‑20℃下震荡或搅拌处理10～20h，处理结束后进行磁性分离，得去除展青霉素的柑橘汁。...

【技术特征摘要】
1.一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22～-18℃下的预冷8-16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56～-52℃，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；(2)Fe3O4磁性纳米粒子的制备：按摩尔比(1.6-2.0)：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的容器中，加入盐酸和PEG-2000，控制温度33-36℃，搅拌并N2保护条件下，快速加入氨水，滴加至pH为9-9.5，搅拌10-30min后于水浴恒温70℃熟化20-40min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子，备用；(3)磁性Fe3O4/CTS微球的制备：称取Fe3O4磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5％的乙酸溶液，Fe3O4磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span-80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2-4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe3O4/CTS微球，备用；(4)固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀10-15h后，加入步骤(1)制备的失活酵母菌粉，调pH＝6，25-35℃下固定化反应1.5-3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC17...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭帮柱，潘思轶，徐晓云，薛淑静，关键，范刚，胡昊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42