本发明专利技术公开了一种新的D型人M1叉头蛋白异构体——FOXM1D，编码FOXM1D的多核苷酸序列以及FOXM1D蛋白序列。本发明专利技术还公开了FOXM1D的多核苷酸和蛋白的用途，包括FOXM1D具有诱导肿瘤出现上皮‑间质转化并促进肿瘤细胞侵袭的功能，故FOXM1D可用于临床诊断标志物以及治疗靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及一种D型人M1叉头蛋白异构体蛋白(Forkhead box protein M1D，FOXM1D)及其编码的多核苷酸序列。
技术介绍
目前，恶性肿瘤仍是危害人类健康的全球卫生问题之一。在我国，随着人口老龄化进程、工业化、不良生活方式及环境污染等原因，恶性肿瘤病人每年呈递增趋势。肿瘤转移是患者死亡的关键原因，是决定治疗和预后的重要指标。外科手术及辅助治疗能够治愈界限清晰的原位肿瘤，而肿瘤转移灶由于其特殊的系统特征导致绝大多数不可治愈(Valastyan and Weinberg,2011)。因此，大于90％的癌症死亡是由转移导致的(Gupta and Massague,2006；Steeg,2006；Valastyan and Weinberg,2011)。此外，临床上60％以上的恶性肿瘤患者在发现时已经转移。基于此，对于恶性肿瘤转移的机制阐明将为治疗恶性肿瘤提供重要的理论基础。肿瘤转移分为如下几步复杂的过程：原发肿瘤发展为侵袭性肿瘤，肿瘤细胞侵袭床头基底膜，肿瘤细胞进入淋巴系统及血液循环系统，在循环系统中的肿瘤细胞转运到靶器官，肿瘤细胞穿出血管形成微小转移灶，肿瘤血管新生及在继发灶定居生长等这几个阶段。上皮间质转换(EMT,epithelial-mesenchymal transition)是在协助肿瘤转移中至关重要的细胞学事件，这种细胞表型转换允许肿瘤细胞摆脱细胞与细胞间连接而更具有侵袭性。EMT的发生是一个复杂的动态过程，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，而其具体调控机制并未完全阐明。M1叉头蛋白(FOXM1,Forkhead box protein M1)属于一个庞大的转录因子家族，因其包含共有的叉头DNA结合域而得名(Halasi and Gartel,2013；Katoh et al.,2013；Wierstra,2013a；Wierstra,2013b)。目前，FOXM1已有三种可变剪切体，即FOXM1A,FOXM1B和FOXM1C。FOXM1B及FOXM1C作为转录活性分子，而FOXM1A则作为转录抑制因子发挥作用。此外，Kim YH报道了一个新的FOXM1转录本——FOXM1ΔC，在多种肿瘤细胞中存在(Kim et al.,2013)。研究发现，FOXM1在几乎所有肿瘤中均异常表达。通过控制一系列在细胞周期进程相关基因，FOXM1作为诱导有丝分裂及特异调控增殖的癌基因发挥作用。近来的一些研究显示FOXM1在侵袭及血管生成等方面发挥重要作用。FOXM1同样能够上调LOX及Slug的表达水平，进而减少E-cadherin的表达。综上，FOXM1是EMT及肿瘤转移的关键调控分子。但是，对于FOXM1调控肿瘤转移的详
细机制还需进一步阐述。随着近年来免疫治疗和生物治疗的发展，恶性肿瘤的治疗取得了突破性进展。但是对于晚期转移肿瘤病人，其生存期及生活质量仍是目前恶性肿瘤治疗面临的严峻问题。因此，对于肿瘤转移患者的早期诊断和治疗仍是肿瘤领域亟待解决的问题，而缺乏合适的诊断标志物和有效的药物治疗靶点是重要原因。
技术实现思路
为了解决上述肿瘤治疗中的问题，本专利技术利用分子生物学手段发现了FOXM1的一个新的异构体——FOXM1D，并发现了其在诱导EMT、促进肿瘤转移等方面的显著功能。一方面，本专利技术通过GeneRace的手段发现了上述的异构体，经GeneRace后获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中包含了FOXM1D的IV、V、VI、VII、VIIa的外显子序列，该异构体FOXM1D能够通过其外显子IV-V-VI-VII-VIIa编码的蛋白或多肽与ROCK1/2的coiled-coil结构域相互作用进而调控细胞骨架及EMT，促进肿瘤转移，该蛋白质在大肠癌病人的组织中显示出与预后的显著相关性。进而，本专利技术提供了一种D型人M1叉头蛋白FOXM1D，该蛋白选自下组：(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸参加的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽；(c)与SEQ ID NO:1氨基酸序列有≥95％同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽。进一步，本专利技术提供了上述人FOXM1D蛋白的编码基因，该基因具有如SEQ IDNO:2所示的多核苷酸序列，该序列的845-1332位对应于SEQ ID NO:3，其中包含了FOXM1D特有的IV、V、VI、VII、VIIa外显子序列。进而，本专利技术提供了一种核酸，该核酸具有：(a)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；或(b)与SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列互补的序列。更进一步，本专利技术提供了一种核酸，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白；优选地，上述核酸具有：(a)如SEQ ID NO:2所示的序列中845-1332位的序列；或(b)如SEQ ID NO:2所示的序列中1-2361位的序列。另一方面，本专利技术提供了一种蛋白或多肽的制备方法，包括步骤：1)构建含有如下(a)或(b)所述的核酸的载体：(a)具有如SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的核酸；(b)具有与SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列互补序列的核酸；2)将构建的载体转染入宿主细胞；3)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；4)从培养物中分离出具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽；5)人工合成具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽。进而，本专利技术提供了一种载体，其含有如下(a)或(b)所述的核酸：(a)具有如SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的核酸；(b)具有与SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列互补序列的核酸。进一步，本专利技术还提供了一种遗传工程化细胞，其含有上述的载体。更进一步，本专利技术还提供了一种过表达具有如SEQ ID NO:2所示序列的核酸的细胞，以及一种敲减具有如SEQ ID NO:2所示序列的核酸的细胞。第三个方面，本专利技术还提供了D型人M1叉头蛋白FOXM1D作为预后肿瘤病人的一种标志物的应用，以及作为肿瘤治疗靶点进行药物设计的应用。上述的应用的一种优选实施方式表现为一种能与所述D型人M1叉头蛋白全长或部分片段特异性结合的抗体、化合物或其他物质；另一种优选实施方式表现为一种药物组合，其含有安全有效量的所述D型人M1叉头蛋白的拮抗剂或激动剂，以及药学上可接受的载体；又一种优选实施方式表现为一种用于药物测试的动物模型，该模型通过基因工程方法外源性转入包含具有SEQ ID NO:2核苷酸序列其互补序列的核酸，并外源性表达所述D型人M1叉头蛋白；再一种优选实施方式表现为一种检测方法，检测具有SEQ ID NO:2核苷酸序列或其互补序列的核酸和/或所述D型人M1叉头蛋白在不同组织或体液中的含量。进一步，本专利技术还提供了一种确定测试化合物或抗体是否是人FOXM1D蛋白的拮抗剂或激动剂的方法，其包括步骤：1)将测试化合物或抗体加入体外培养细胞的培养体系作为测试组，并将体外培养的相同细胞作为对照组，其中所述的细胞来自于哺本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种D型人M1叉头蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸参加的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽；(c)与SEQ ID NO:1氨基酸序列有≥95％同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽。
【技术特征摘要】
1.一种D型人M1叉头蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸参加的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽；(c)与SEQ ID NO:1氨基酸序列有≥95％同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭迁移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽。2.一种核酸，其特征在于具有：(a)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；或(b)与SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列互补的序列。3.一种核酸，其特征在于，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白。4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，该核酸具有：(a)如SEQ ID NO:2所示的序列中845-1332位的序列；或(b)如SEQ ID NO:2所示的序列中1-2361位的序列。5.一种载体，其特征在于，其含有如权利要求2所述的核酸。6.一种遗传工程化细胞，其特征在于，其含如有权利要求5所述的载体。7.一种蛋白或多肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：1)构建含有如权利要求5所述的载体；2)将构建的载体转染入宿主细胞；3)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；4)从培养物中分离出具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽；5)人工合成具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡维国，张鑫，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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