一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法技术

一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，包括如下步骤：配置不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1‑10μg/μL；分别将不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，两者的滴加量相同；用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。本发明专利技术的半定量检测方法所需样品量少、灵敏度可达0.1μg/μL，且具有快速、简单、不需要昂贵的仪器等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质
，具体涉及一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法。
技术介绍
蛋白质溶液浓度检测是一种常用的生物学检测方法。目前主要的检测方法有如下几种：第一：检测蛋白质溶液在280nm处的吸光值(即A280数值)。一般情况下，A280＝1时，蛋白质溶液的浓度为1μg/μL，其原理是蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质浓度。该方法使用紫外分光光度计，普通的紫外分光光度计操作复杂，而且只能检测100μl以上样品，而检测微量样品(比如1μl溶液样品)的紫外分光光度计价格昂贵，比如美国赛默飞(Thermo Fisher)Nanodrop 2000型号的紫外分光光度计价格在10万元以上。因此，该方法存在如下缺陷：必须配备紫外分光光度计，且普通的紫外分光光度计需要样品量大，而高端的紫外分光光度计则非常昂贵。第二，检测溶液中蛋白质的质量，再结合溶液体积计算蛋白质溶液的浓度。其原理是将一定浓度的标准蛋白质溶液与待测样品一起进行聚丙烯酰胺凝胶分析，然后使用软件对比标准蛋白质溶液与待测样品在凝胶上的蛋白质质量，获得待测样品蛋白质质量，再结合溶液体积获得蛋白质溶液的浓度。但该方法需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，步骤繁多，整个实验需要3个小时以上，花费时间比较长。第三，考马斯亮兰法(Bradford法)检测蛋白质浓度，其原理是将标准蛋白质溶液与待测样品分别加入Bradford检测液中，混匀，检测混合溶液在595nm处的吸光值(即A595数值)，作标准蛋白质溶液与吸光值相关性的标准曲线。然后，根据标准曲线推导蛋白质溶液浓度与吸光值相关性的公式，将待测样品吸光值导入公式计算出样品蛋白质溶液的浓度。但
该方法在检测微量样品(例如小于50μL的蛋白质溶液)时必须配备酶标仪，设备比较昂贵，比如美国博腾(BioTek)Epoch型号的酶标仪价格在30万元以上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，该方法具有快速、简单、成本低、样品量小、灵敏度高等优点。为了实现上述目的，本专利技术的主要技术方案如下：本专利技术基于如下理论和方法实现：染色液中的考马斯亮蓝和蛋白质中的芳香族氨基酸残基结合，当它与蛋白质结合后，蛋白质和色素的结合物为蓝色，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而且在室温下蛋白质和色素的结合物比较稳定(1小时内)。因此，考马斯亮蓝可用于蛋白质的定量测定。本专利技术将蛋白质吸附到滤纸上后，加入染色液，在滤纸上形成蛋白质和色素的结合物，然后使用自来水冲洗滤纸。由于蛋白质和色素的结合物分子量较大，难以冲洗。因此，自来水冲洗滤纸后，滤纸上大部分染色液被去除，留下蛋白质和色素的结合物显色，可以从显示颜色的深浅判断蛋白质溶液浓度范围。一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其包括如下步骤：1)配置不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1-10μg/μL；分别将至少两种不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，不同浓度的标准蛋白质溶液和待测样品的滴加量相同；2)用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；3)通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。进一步，步骤1)中，所述标准蛋白质溶液和所述待测样品的滴加量均≥1μL。步骤2)中，所述染色液包括0.01-0.1％考马斯亮蓝R-250，0.01-0.1％考马斯亮蓝G-250，5-40％酒精，5-40％冰醋酸。又，所述滤纸为慢速定量滤纸、中速定量滤纸、快速定量滤纸、慢速定性滤纸、中速定性滤纸或快速定性滤纸。优选的，所述滤纸为慢速定性滤纸。本专利技术通过将蛋白质溶液中蛋白质吸附在滤纸上后，利用染色液使不同浓度的蛋白质溶液在滤纸上的显色深浅不同，再与标准蛋白质溶液在滤纸上的显色比对来确定待测样品中蛋白质浓度范围，如果待测样品的显色深浅处于两个不同浓度的标准蛋白质溶液的显色之间，则待测样品的蛋白质浓度处于该标准蛋白质溶液的两个不同浓度之间。本专利技术的有益效果：本专利技术所提供的检测方法需要的样品量少，1μL样品量即可进行半定量检测；灵敏度高，具体可以达到0.1μg/μL，可检测微克级的蛋白质；检测结果的准确性不受标准蛋白质溶液的缓冲液种类的影响；成本低，不需要昂贵的仪器和设备即可操作。本专利技术所需的标准蛋白质溶液配置完成后，可以储存于-20℃冰箱中，备用；染色液储存于室温中，备用。因此，本专利技术通过事先配置好的标准蛋白质溶液和染色液用于该半定量检测过程中，实验步骤少，操作简单，整个过程只需要2分钟，并且样品数量的增加不会导致实验时间的大量增加，大大节约了时间。附图说明图1为本专利技术实施例1不同类型滤纸上的检测结果图。图2为本专利技术实施例2不同缓冲液配置标准蛋白质溶液后的检测结果图。图3本专利技术实施例3的检测结果图。图4为对比例2中BSA标准蛋白质溶液和待测样品的聚丙烯酰胺凝胶图。图5为对比例3中BSA标准蛋白质溶液的A595吸光值和浓度相关标准直线图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。下列实施例中如无特殊说明，均为《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002年)所记载的方法。以下实施例中，化学试剂和实验材料从杭州南天生物科技有限公司购买。使用美国赛默飞(Thermo Fisher)Nanodrop2000型号的紫外分光光度计检测蛋白质溶液浓度中A280数值，检测蛋白质溶液中蛋白质含量的聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪为美国伯乐(BioRad)Mini Protean 3 Cell型号电泳槽和Powerpac型号电泳仪，使用美国伯乐(BioRad)QuentityOne凝胶分析软件检测和对比蛋白质溶液中蛋白质含量。聚丙烯酰胺凝胶染色和脱色使用华城润华TY-80A/S型号水平摇床。移液枪为德国Eppendorf公司的Research Plus系列。实施例1.检测的蛋白质溶液浓度范围和最佳滤纸类型本实施例使用慢速、中速、快速的定量滤纸和定性滤纸(购自GE公司的Whatman牌滤纸)进行试验，检测滤纸对蛋白质的吸附力以及自来水冲洗后的检测效果。配置不同浓度的标准蛋白质溶液，检测本专利技术可以检测到的蛋白质溶液浓度范围，本实施例中使用模式蛋白质牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质溶液。为了检测不同滤纸对蛋白质的吸附力，蛋白质溶液的体积从实验室可操作的最低量1μL逐渐递增到3μL。具体试验步骤如下：1)配置标准蛋白质溶液牛血清白蛋白BSA，浓度设置为0.1μg/μL、2μg/μL、5μg/μL。2)对滤纸进行编号：慢速定量滤纸(1号)、中速定量滤纸(2号)、快速定量滤纸(3号)、慢速定性滤纸(4号)、中速定性滤纸(5号)、快速定性滤纸(6号)。3)使用1-10μL量程的移液枪分别将1μL、2μL、3μL的步骤1)配置的不同浓度BSA标准蛋白质溶液加在1-6号滤纸上，放置10秒以上，让
蛋白质充分吸附在滤纸上。4)将1-6号滤纸放置在培养皿中，加入2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其包括如下步骤：1)配置至少两种不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1‑10μg/μL；分别将不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，标准蛋白质溶液和待测样品的滴加量相同；2)用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；3)通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。

【技术特征摘要】
1.一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其包括如下步骤：1)配置至少两种不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1-10μg/μL；分别将不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，标准蛋白质溶液和待测样品的滴加量相同；2)用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；3)通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。2.根据权利要求1所述的半定量检测蛋白质溶液浓度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新其，方军，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31