基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法技术

本发明专利技术提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，包括以Fe3O4纳米颗粒为固相载体，制备出表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的免疫磁性颗粒，将DNMT1标准品或待测样品采用所述免疫磁性颗粒捕获并富集分离，然后向分离后所得的产物中加入被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，使抗体与待测抗原结合，采用多功能微孔板读数仪以270 nm激发下进行荧光检测，根据荧光强度与DNMT1标准品或待测样品浓度的关系建立回归方程。该方法步骤简单且由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测
，具体的说，涉及了一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。
技术介绍
在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已经以“双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通常作法是：将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但存在固相载体的分离效率较低、检测精度不高等缺点。为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种以纳米固相颗粒为载体，具有分离效率高、检测精度高且具有高度特异性的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为Fe3O4@McAb；提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记作为QDs@PcAb；将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270nm激发下反应产物的荧光强度；根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。需要说明的是，上述各步骤中，CB代表碳酸盐缓冲液、PBS代表磷酸盐缓冲溶液、PBST代表添加Tween-20非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液。基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤。基于上述，提供一种所述Fe3O4@McAb的步骤包括：（1）清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为0.01 mol/L～0.015mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min～5 min，然后进行磁分离弃上清得到第一沉淀物。其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液；（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，磁分离、弃上清处理后采用MES缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物。其中，EDC代表(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺溶液、MES代表吗啉乙磺酸缓冲液、mg/mL代表毫克每毫升；（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5h～2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；（5）封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5h～1h，磁分离、弃上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3～4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb；其中BSA封闭液代表牛血清白蛋白封闭液；（6）保存：在偶联产物Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用。基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法中，采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤包括：（1）将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的Fe3O4@McAb加入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；其中mmol/L代表毫摩尔每升；（2）采用PBS缓冲液配制浓度为300 ng/mL～400 ng/mL的DNMT1标准品，并将其加入上述酶标板中，恒温箱中温育80min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；其中ng/mL代表纳克每毫升；（3）采用封闭液将DNMT1多克隆抗体稀释400～500倍，然后将其以每孔100 微升加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；（4）用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000～5000倍，以每孔100 微升将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；（5）将TMB显色剂A液和B液等体积混合，将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃避光温育反应15 min～20 min；显色反应后，向所述酶标板中加入H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测各孔的吸光度OD，其中，检测波长为450nm。基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤。基于上述，基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供一种所述QDs@PcAb的步骤包括：将pH为7.0～7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升～1 微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗体，每次加入上述物质后均需振荡混匀；其中、mg/mL代表毫克每毫升；然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下涡旋反应1.5h～2h，反应结束后向所述PE管中加入含0.5%质量百分数BSA封闭液的PBS缓冲液，在18℃～25℃下涡旋反应20 min～30 min；所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4℃保存，从而制得所述QDs@PcAb。基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法中，采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤包括：将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的QDs@PcAb加入到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min～90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功微孔板读数仪上测荧光强度。基于上述，所述的一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括将上述各步骤中各参数的优化的步骤，然后根据优化参数建立检测DNMT1的回归方程，其中，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒，记为Fe3O4@McAb；提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记为QDs@PcAb；将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。

【技术特征摘要】
1.一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒，记为Fe3O4@McAb；提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记为QDs@PcAb；将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。2.根据权利要求1所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，它还包括采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤。3.根据权利要求1或2所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供一种所述Fe3O4@McAb的步骤包括：（1）清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后，采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2min～5 min，然后进行磁分离、弃上清处理得到第一沉淀物；（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL的NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，经磁分离、弃上清处理后，采用MES缓冲液对其洗涤3～4次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物；（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5 h～2 h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；（5）封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5 h～1 h，磁分离、弃上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3～4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb；(6)保存：在Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用。4.根据权利要求3所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤包括：（1）将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的Fe3O4@McAb加入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板拍干备用；（2）采用PBS缓冲液配制浓度为300 ng/mL～400 ng/mL的DNMT1标准品，并将其加入上述酶标板中，恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴拥军，刘利娥，熊亚敏，玉崧成，于斐，何磊良，屈凌波，王华栋，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41