本发明专利技术涉及用于生物合成[S,S]‑乙二胺二琥珀酸（[S,S]‑EDDS）的分离的核酸和蛋白或肽、表达载体和缺失载体、宿主细胞和缺失突变体、用于生物合成[S,S]‑EDDS的方法和试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】说明书应用领域和现有技术本专利技术涉及用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸（[S,S]-EDDS）的分离的核酸和蛋白或肽、表达载体和缺失载体、日本拟无枝酸菌（Amycolatopsis japonicum）属的宿主细胞和缺失突变体和用于生物合成[S,S]-EDDS的方法和试剂盒。乙二胺二琥珀酸（EDDS，也被称为乙二胺二琥珀酸）是六齿的螯合剂。EDDS具有两个立体中心且因此存在三个不同的立体异构体，即[R,R]-EDDS、[S,S]-EDDS和[R,S]-(内消旋)-EDDS。已证实仅有[S,S]-EDDS立体异构体可完全生物降解（Schowanek 等人,Chemosphere (1997), 34(11): 2375-91）。此外，EDDS是乙二胺四乙酸（EDTA）（广泛使用且也是六齿的螯合剂）的结构异构体。这两种化合物在其化学特征上，特别是在其与金属离子形成络合物的能力方面非常相似。因此，EDDS和EDTA对一整系列的金属离子展示出相当的络合物形成常数。由于其显著的形成络合物的能力，数十年来EDTA已在各种不同领域中用于去除金属离子，且目前是最常用的络合剂。其与铜(II)、镍(II)、铁(III)和钴(II)离子，且也与重金属离子和与钙离子和镁离子形成特别稳定的络合物。因此，EDTA特别作为软水剂添加至洗涤剂中，在造纸和纺织工业领域中用于稳定化漂白浴（Bleichbad），且以铁、铜和锌络合物的形式用作肥料。此外，EDTA在医疗领域中用于治疗重金属中毒。缺点是EDTA不可生物降解，同时可因此在无处不在的水中检测到。因此，其特别被认为是生态有害的，这是因为其可从沉积物中溶解出重金属并因此使它们具有生物可用性。在该背景下期望的是，根据可持续材料政策，通过等效的但生物可降解的化合物取代EDTA。由于与EDTA相当的络合物形成常数，以生物可降解的立体异构体[S,S]-EDDS形式的EDDS通常是合适的替代物。[S,S]-EDDS在三价钴存在下由L-天冬氨酸和1,2-二溴甲烷的化学合成是熟知的（Neal和Rose, Inorganic Chemistry (1968), 7(11): 2405-12）。缺点是在此作为毒性副产物产生的溴化氢，其必须复杂地去除。此外，所述合成使用化石反应物完成。此外，非对映选择性的化学方法是熟知的，其中使马来酸或马来酸酐与乙二胺反应，由此除 50 %的内消旋-EDDS外还产生[R,R]-EDDS和[S,S]-EDDS作为外消旋混合物。然而，由于只有[S,S]-EDDS的低产率和基本上非常复杂的外消旋物分离，该方法通常不适合用于工业应用。用于制备[S,S]-EDDS的生物催化的方法公开于EP 0 731 171 A2。使用该文所述的方法，可由富马酸和乙二胺在具有裂解酶活性的微生物的作用下以高达97%的光学纯度获得[S,S]-EDDS。另一种用于制备[S,S]-EDDS的生物催化的方法在EP 1 043 400 A1中公开，其中可由马来酸和乙二胺在具有马来酸异构酶活性的微生物和金属离子的存在下以高达98%的光学纯度获得[S,S]-EDDS。然而，以上两种生物催化的方法基于使用不能由所用微生物自身提供的合成前体。另外熟知的是借助细菌物种日本拟无枝酸菌生物合成[S,S]-EDDS（Zwicker 等人, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1997); 19(4): 280-285）。 然而，在此的缺点是该生物合成依赖于锌，且在培养基中2 µM的锌浓度就可导致[S,S]-EDDS的合成几乎完全中断（Cebulla I., 论文(1995), Tübingen大学）。在无锌反应条件下借助日本拟无枝酸菌通过使用优化的培养基来制备[S,S]-EDDS的方法在WO 96/36725 A1中描述。对于[S,S]-EDDS的一般生物合成方法而言的问题特别是如下事实，即由于锌依赖性和与其相关的低产率，更大规模的合成应用被证明是困难和不经济的。因此，在培养基和发酵器中产生无锌环境涉及巨大的费用且几乎不可行。目的和实现方式基于该背景，本专利技术的目的因此是提供用于生物合成[S,S]-EDDS的蛋白或肽、核酸、基因簇、载体、宿主细胞、细菌细胞以及方法和试剂盒。该目的通过根据权利要求1、4、6和9 的蛋白或肽、通过根据权利要求2、3、7和8的核酸、通过具有权利要求5的特征的基因簇、通过根据权利要求10和13的特征的载体、通过具有权利要求11的特征的宿主细胞、通过具有权利要求12的特征的细菌细胞、通过具有权利要求15的特征的方法以及通过具有权利要求16的特征的试剂盒实现。如权利要求13定义的载体的优选实施方案描述在从属权利要求14中。全部权利要求的条文在此通过明确引用并入本说明书的内容。本专利技术人首先成功地以日本拟无枝酸菌为例鉴定和提供能用于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸（在下文称为[S,S]-EDDS）的基因和蛋白。此外，本专利技术人首先成功地解释基于所述生物合成的锌依赖性的机理。由此，特别有利的是相比于一般方法更经济且更高效地制备[S,S]-EDDS，特别是以更高产率和更大纯度。对此，下文描述的本专利技术主题是基础。在第一个方面中，本专利技术涉及分离的蛋白或肽，其优选对于生物合成[S,S]-EDDS的部分合成步骤具有功能性，即使得能够进行这样的部分合成步骤。在本专利技术的范围中，术语“生物合成”限定的不仅是[S,S]-EDDS的胞内合成，还包括摄取进入细胞和从细胞排出（经由细胞膜的运输）。所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 1、SEQ ID No.3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ IDNo. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 35、SEQ IDNo. 37、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 57和SEQ IDNo. 59。在本专利技术范围中，术语“蛋白”可以不仅是指单个本专利技术的蛋白或肽，还可以是指多种不同的本专利技术的蛋白或肽的组合。本专利技术的蛋白或肽可以通过化学或重组，即生物技术的方式来制备。可选地，本专利技术的蛋白或肽可以源自细菌，特别是革兰氏阳性菌，优选源自拟无枝酸菌属的细菌，特别优选源自日本拟无枝酸菌物种的细菌，或从这样的细菌提取。在一个优选的实施方案中，所述蛋白或肽包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的蛋白或肽，其对于生物合成[S,S]‑乙二胺二琥珀酸的部分合成步骤具有功能性，并包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53及其组合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.03 DE 102013217543.41.分离的蛋白或肽，其对于生物合成[S,S]-乙二胺二琥珀酸的部分合成步骤具有功能性，并包含或由选自以下的氨基酸序列构成：SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No.43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53及其组合。2.分离的核酸，其包含或由选自以下的核酸序列构成：a）编码根据权利要求1的蛋白或肽的核酸序列；b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；c）相当于根据a）的核酸序列的互补链的核酸序列，及其组合。3.分离的核酸，其包含或由选自以下的核酸序列构成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No.42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQID No. 54及其组合。4.分离的蛋白或肽，其通过包含或由选自以下的核酸序列构成的基因的表达来制备：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ IDNo. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其组合。5.分离的基因簇或操纵子，其包含或由至少两个选自以下的核酸序列构成：SEQ IDNo. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其组合。6.分离的蛋白或肽，其对于抑制[S,S]-乙二胺二琥珀酸的生物合成具有功能性，其包含或由根据SEQ ID No. 61的氨基酸序列构成。7.分离的核酸，其包含或由选自以下的核酸序列构成：a）编码根据权利要求6的蛋白或肽的核酸序列；b）通过用同义密码子交换至少一个密码子而不同于根据a）的核酸序列的核酸序列；c）相...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·施特格曼，W·沃来本，M·施波恩，T·韦伯，
申请(专利权)人：E·施特格曼，W·沃来本，M·施波恩，T·韦伯，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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