本发明专利技术提供了一种分离的或重组的多肽，该多肽包括相对于相应的野生型P450还原酶缺少N末端氨基酸的改性P450还原酶，并且包括含有序列HDEL或KDEL的表位标签，或者由其组成。相比于与野生型P450还原酶共表达时的细胞色素P450的活性和/或表达，当与细胞色素P450共表达时，所述改性P450还原酶提高细胞色素P450的活性和/或表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白表达的方法。具体地，本专利技术涉及细胞色素P450表达系统以及细胞色素P450还原酶(CPR)的产生。
技术介绍
细胞色素P450(CYP)属于解毒酶大家族(存在于人体的不同部位，特别是肝、肾、肺、中枢神经系统中)，其参与多种外源性物质(xenobiotics)的降解(break-up)(即，代谢)，所述外源性物质包括大部分药物、多种膳食物质和各种各样的环境化学品。外源性物质被定义为被有意或无意地引入至人机体的外源性化学物质。CYPs参与90％的在人体内发生的外源性物质的代谢。CYPs通过氧的作用代谢外源性物质，使其溶解性更好且更易于排出。在药物研发过程中，将化合物引入人体临床试验之前，有必要确定该产品的代谢率以及性质和毒性。目前，CYPs的主要商业用途为用于那些已经在研发中的药物化合物的代谢的研究。在次级试验中，大部分情况下使用少量的CYPs(因为高成本)以确定代谢途径。然而，在临床前研究中，将CYPs用于大量的潜在候选药物的筛选可以大大地降低后期药物研发失败的制药公司的成本。因此，有必要研发出表达具有高活性和/或高表达水平的CYPs的改良系统，以能够用于药物化合物，特别是用于毒性的候选药物的筛选。人P450还原酶(hRD)是一种锚定于内质网(ER)膜的酶，并且其作为对细胞色素P450同工酶的活性起必要作用的辅助因子而发挥作用。通常，作为辅助因子，P450还原酶具有酶活性。它对于ER膜结合细胞色素P450
(CYP)酶的活性是必需的。对于ER膜结合CYP酶的重组表达，需要共同生产P450还原酶。来源于任意生物体的细胞色素P450还原酶从NADPH获得电子并且将其传递至CYP的活性位点，使得二价氧可以转变成活性形式以形成活性氧(ROS)。该ROS被用于将-O-添加至非活性碳原子。在自然情况下，CPRs对于活细胞是有毒性的，因为它们不断地参与ROS的产生。即使ROS轻微过量的生成，也可以杀死被用于共同生产CYP和CPR的细胞。这造成了CYP重组过表达的问题，因为它导致重组CYP的产量极低。从WO2007/129050现有技术中获知了毒性降低的P450还原酶的形式。该改性还原酶不包括野生型还原酶的N末端氨基酸。该截短的还原酶是可溶解的，即，其未被整合于ER膜，但是其仍具有还原酶活性。另外，具有12个氨基酸的c-myc标签被加入至该还原酶的3’末端。
技术实现思路
第一方面，本专利技术提供了一种分离的或重组的多肽，该多肽包括或由下述组成：相对于相应的野生型P450还原酶缺少N末端氨基酸的改性P450还原酶，并且包括含有序列HDEL(SEQ ID NO：1)或KDEL(SEQ ID NO：2)的表位标签，其中，相比于与野生型P450还原酶共表达时的细胞色素P450的活性和/或表达，当与细胞色素P450共表达时，所述改性P450还原酶提高细胞色素P450的活性和/或表达。本专利技术意外发现WO2007/129050公开的可溶性P450还原酶(其不是膜整合的)通过在C末端添加具有12个氨基酸的c-myc标签肽序列而被滞留
在ER中。这在WO2007/129050中是无法预期的。因此，本专利技术提供了具有ER滞留信号的改性P450还原酶的可选形式。这些P450还原酶表现出较高的产量和CYP活性。本专利技术的多肽是膜整合酶，因为它们可以与微粒体相分离。与野生型还原酶或WO2007/129050的可溶性还原酶相比，它们导致较少的ROS形成。因此，本专利技术的多肽与一种CYP的共表达可产生更多的CYPs。进一步地，与野生型还原酶相比，本专利技术的多肽产生的CYP活性较高；因此，它们与CYPs偶联优于野生型还原酶。细胞色素P450的活性可以通过EROD试验或本领域公知的其它试验进行测量。细胞色素P450的表达可以使用本领域公知的CO差光谱法进行测量，并在本文的实施例中进行了描述。本专利技术的P450还原酶通过截短N末端而缺少N末端氨基酸。该截短部分可以包括N末端膜锚定序列，其可以含有24个N末端氨基酸。该序列的缺失导致可溶性P450还原酶蛋白的形成，即，该蛋白未整合至内质网膜上。共有54个氨基酸可以从N末端被截短。该缺失的54个氨基酸结构域已经在现有技术中作为用于hRD的膜锚定结构域而进行描述。所述表位标签可以被连接至所述多肽的C末端，通过连接子或者优选地通过直接连接。所述连接子可以含有两个丝氨酸和/或甘氨酸残基。所述P450还原酶可以为人P450还原酶。本专利技术的多肽可以包括或由如图8所示并且被标记为“delN1hRD-HDEL_PR”(缺少24个N末端氨基酸残基–SEQ ID NO：3)的氨基酸序列或如图8所示并且被标记为“delN2hRD-HDEL_PR”(缺少54个N末端氨基酸残基–SEQ ID NO：4)的氨基酸序列组成。本专利技术还提供了包括或由如图8所示并且被标记为“delN1hRD-HDEL_PR”(缺少24个N末端氨基酸残基)的氨基酸序列或如图8所示并且被标记为“delN2hRD-HDEL_PR”(缺少54个N末端氨基酸残基)的氨基酸序列组成的多肽，其中，氨基酸序列HDEL(SEQ ID NO：1)
被序列KDEL(SEQ ID NO：2)所取代。所述HDEL表位标签为酵母ER滞留信号。因此，含有该标签的本专利技术的多肽可以在酵母细胞中表达。当与细胞色素P450共表达时，CYP的水平和活性得到提高。在酵母中进行生产的过程中，偶联至人和植物CYPs的野生型酵母P450还原酶(yRD)远远优于hRD。遗憾的是，yRD的毒性远高于hRD，因为yRD产生的ROS显著地降低了重组CYPs的水平。因此，所述P450还原酶可以为酵母P450还原酶。通常情况下，这种还原酶不仅可以改善基于酵母的人CYP产生系统，还可以促进用于生物转化的酵母中植物CYPs的产生。面包酵母(Baker’s yeast)是一种模拟人细胞的单细胞真核细胞。此外，所述P450还原酶可以是非人的哺乳动物P450还原酶(例如来源于啮齿动物，如豚鼠、仓鼠、小鼠、兔、大鼠)。可选地，所述P450还原酶可以来源于植物或真菌。这些P450还原酶的序列可以从NCBI数据库获得。本专利技术的P450还原酶可以被用于酵母细胞，以及昆虫和哺乳动物细胞中细胞色素P450酶的生产。包括相对于上述多肽的一个或多个添加、缺失、取代或类似的多肽，如同源体和片段，也包括在本专利技术的范围内。另外，将一种氨基酸替换为另一种相似“类型”的氨基酸是可能的。例如，疏水性氨基酸可以被取代为另一种氨基酸。在这种经过改造的多肽的实例中，与本文所述的多肽的同一性程度不如该多肽被保留的性能重要。然而，在合适的情况下，本专利技术提供了与本文所述的多肽序列具有至少60％同一性的同源体，其被包括在本专利技术中。优选地，本专利技术提供了具有至少70％同一性，更优选至少80％同一性的同源体。最优选地，本专利技术提供了具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或者更高同一性的同源体。两条氨基酸序列或两条核酸(核苷酸，nucleotide)序列的“同一性百分
数”通常通过用于最佳对比目的(例如，为了与其它序列进行最佳比对，可以在任一序列中引入空位)的序列的比对以及在相应的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的或重组的多肽，该多肽包括或由下述组成：相对于相应的野生型P450还原酶缺少N末端氨基酸的改性P450还原酶，并且包括含有序列HDEL或KDEL的表位标签，其中，相比于与野生型P450还原酶共表达时的细胞色素P450的活性和/或表达，当与细胞色素P450共表达时，所述改性P450还原酶提高细胞色素P450的活性和/或表达。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 GB 1322740.01.一种分离的或重组的多肽，该多肽包括或由下述组成：相对于相应的野生型P450还原酶缺少N末端氨基酸的改性P450还原酶，并且包括含有序列HDEL或KDEL的表位标签，其中，相比于与野生型P450还原酶共表达时的细胞色素P450的活性和/或表达，当与细胞色素P450共表达时，所述改性P450还原酶提高细胞色素P450的活性和/或表达。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述P450还原酶通过截短N末端而缺少N末端氨基酸。3.根据权利要求2所述的多肽，其中，所述截短包括24个N末端氨基酸。4.根据权利要求3所述的多肽，其中，所述截短包括54个N末端氨基酸。5.根据前述权利要求中任意一项所述的多肽，其中，所述表位标签被连接至所述多肽的C末端。6.根据前述权利要求中任意一项所述的多肽，其中，所述P450还原酶为人P450还原酶。7.根据权利要求6所述的多肽，其中，所述多肽含有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成，可选地，其中，氨基酸序列HDEL被序列KDEL所取代。8.根据权利要求1-5中任意一项所述的多肽，其中，所述P450还原酶为酵母P450还原酶。9.编码前述权利要求中任意一项所述的多肽的核酸。10.含有权利要求9所述的核酸分子的载体。1...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·乔杜里，
申请(专利权)人：德蒙特福特大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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