本发明专利技术涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤：1）检测的前期准备；2）粮食样品硒形态的提取；3）建立HPLC-HGAFS联用技术；4）上机测试与结果计算。该方法成本低，操作简便，提取效率高，可同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na2SeO4）五种硒形态和含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，属于分析化学领域。
技术介绍
硒是人体必须的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组成成分，具有清除体内自由基、抗细胞脂膜过氧化、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能。硒缺乏会导致克山病、白肌病、地方性癌症等疾病的发病率增高。我国有2/3的地区缺硒，其中1/3地方严重缺硒。根据我国13省份普查显示，人均每日硒摄入量仅为36微克，低于世界卫生组织推荐的日常摄入量50微克的标准，也达不到中国营养学院建议的50-200微克的摄入量，我国居民普遍缺硒。提高我国居民的日常硒摄入量，对于改善国民健康有重大意义。但是，科学、合理地补硒不但要提高人体摄入硒的总量，也要关注人体对于硒的可吸收利用性。研究表明，不同形态硒的吸收利用性、安全性有较大差异。无机硒的吸收效果和安全性远远不及有机硒。我国居民的膳食结构以植物性食品为主，且植物性食品也是居民摄入硒的主要来源。因此，测定植物中的硒形态，对于指导居民科学补硒，开发安全高效的富硒食品，具有指导意义。目前，测试主要硒形态的主要技术为气相色谱（GC）、电泳（CE）高效液相色谱（HPLC）等与HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）、ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）联用技术。但是GC对于硒代氨基酸和硒代蛋白等非挥发性的硒化物的检测存在较多的困难；CE在与ICP-MS联用时，所需流速不同，限制其发展应用；现在主要采用HPLC技术。如：富硒植物材料中硒形态的测定方法（中国专利申请号201110428248.4）中利用HPLC-HGAFS检测富硒植物中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）和亚硒酸钠（Na2SeO4）四种硒态。但由于所用试剂的差异，该方法无法检测出硒的六价形态。植物硒形态的检测方法（中国专利申请号201210215457.5）中采用HPLC-ICP-MS联用技术分析植物样品中的硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na2SeO4）和硒酸钠（Na2SeO4）五种硒态。水产品中硒形态的检测方法（中国专利申请号201310376921.3）利用HPLC-HGAFS联用技术分析水产品中的硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na2SeO4）和硒酸钠（Na2SeO4）四种硒态，该方法主要用于对水产品中硒形态的测定，没有探讨对粮食样品中硒形态测定的适用性。但是，目前ICP-MS价格昂贵，检测成本高，不易推广；而采用HGAFS技术的方法检测硒形态种类又不完善，并且这些方法中都没有提到样品中硒的提取率，有可能检出硒仅为样品中总硒的少部分。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种成本相对较低、硒形态种类检测完备且操作简便、提取效率高的粮食样品中硒形态的测定方法。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术所述粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤：1）检测的前期准备：i）设备：HPLC-HGAFS（型号为LC20AB-SAP-10-AFS9230，色谱柱Hamilton PRP-X100）、天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器（型号KQ-610）、摇床、离心机；ii）试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH4、盐酸、甲酸、(NH4)2HPO4、硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na2SeO4）和硒酸钠（Na2SeO4）标准物质、18.2 MΩ水。2）粮食样品硒形态的提取：i）称取烘干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进行提取，超声；ii）提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡；iii）依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4℃下，10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm滤膜，得到待测溶液。3）建立HPLC-HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术：i）仪器条件：流动相（40 mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；ii）氢化物发生条件：还原剂成分：0.35wt%NaOH+1.2wt%NaBH4，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10wt% HCl，流速：6 mL/min；iii）配制硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na2SeO4）混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图。4）上机测试与结果计算：样品中待测物硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na2SeO4）的含量可由下式计算得：X=C×V×F/m式中：X—样品中待测物质的含量，μg/kg；C—待测液中该物质的浓度，μg/L；V—测定液体总体积，mL；F—稀释倍数；m—称样质量，g。作为优选方案，其中所述步骤2）中，称取样品质量为0.1-0.2 g。作为优选方案，其中所述步骤2）中，样品与提取液Tris-HCl的固液比为1：25-1:100。作为优选方案，其中所述步骤2）中，超声提取时间为10-30 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ。作为优选方案，其中所述步骤2）中，纤维素酶与粮食样品的质量比为1:1-1:10，破壁处理温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间30 min-2 h。作为优选方案，其中所述步骤2）中，蛋白酶K与粮食样品的质量比为1：20-1:100，水解温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。作为优选方案，其中所述步骤2）中，蛋白酶XIV与粮食样品的质量比为1:20-1:100，水解温度控制在30-45℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。作为优选方案，其中所述粮食样品为小麦或玉米。相比现有技术，本专利技术具有以下有益效果：1、采用超声提取，结合多种酶，硒的提取效率高，提取率可达80%以上，且酶用量少，节约成本，提取过程操作简便，易于重复；2、相较于现有方法，可以同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na2SeO4）五种硒形态和含量，且其最低检出限相当低。附图说明图1为各种硒形态的标准分离谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。以下实施例用于说明本专利技术，但不能用来限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。实例1：小麦中硒形本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种粮食样品中硒形态的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1）粮食样品硒形态的提取：i）称取烘干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris‑HCl进行超声提取；ii）提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡；iii）依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4℃下，10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm滤膜，得到待测溶液； 2）建立HPLC‑HGAFS联用技术：i）仪器条件：流动相：40 mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；ii）氢化物发生条件：还原剂成分：0.35wt%NaOH+1.2wt%NaBH4，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10wt% HCl，流速：6 mL/min；iii）配制硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na2SeO4、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Na2SeO4混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图；3）上机测试与结果计算：样品中待测物硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na2SeO4、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Na2SeO4的含量由下式计算得：X=C×V×F/m式中：X—样品中待测物质的含量，μg/kg；C—待测液中该物质的浓度，μg/L；V—测定液体总体积，mL；F—稀释倍数；m—称样质量，g。...
【技术特征摘要】
1.一种粮食样品中硒形态的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1）粮食样品硒形态的提取：i）称取烘干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进行超声提取；ii）提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡；iii）依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4℃下，10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm滤膜，得到待测溶液； 2）建立HPLC-HGAFS联用技术：i）仪器条件：流动相：40 mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；ii）氢化物发生条件：还原剂成分：0.35wt%NaOH+1.2wt%NaBH4，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10wt% HCl，流速：6 mL/min；iii）配制硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na2SeO4、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Na2SeO4混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图；3）上机测试与结果计算：样品中待测物硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na2S...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄阳，刘颖，朱元元，
申请(专利权)人：中国科学技术大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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