本发明专利技术公开了一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用，包括以下步骤：a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50 mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；c、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。本发明专利技术保证被免疫动物健康存活、降低抗血清的生产成本、制备出了高效价的抗血清。
【技术实现步骤摘要】
一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用，属免疫
技术介绍
尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus) 俗称五步蛇,属于蝮亚科、蝮属，分布于我国长江以南地区（包括台湾），是我国特有剧毒蛇。该蛇毒为血循环型毒蛇, 其主要毒素为出血毒素，前人从尖吻蝮蛇毒液中分离出4种出血毒素，被尖吻蝮蛇咬伤后伤口和内脏大量出血，致死、致残率极高。目前治疗尖吻蝮蛇咬伤的有效方法是注射抗血清，传统方法制备全毒抗血清采用福氏佐剂乳化后免疫注射动物的方法，由于乳化后的蛇毒出血活性仍然很强，因此，注射的抗原量比较小，否则被免疫的动物就会死亡，抗原量小导致抗血清效价低，因此治疗效果不佳。制备高效价全毒抗血清对于有效治疗尖吻蝮蛇咬伤，降低致死和致残率有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在利用尖吻蝮蛇毒的出血毒素都含Ca2+,Na2EDTA可以通过螯合Ca2+使出血活性丧失、抗原性仍然保留的特点，全毒中加入Na2EDTA消除出血活性，然后将无出血活性的蛇毒蛋白包围到网状的聚丙烯酰胺凝胶中，将含蛇毒蛋白的凝胶磨细后免疫注射家兔，获得高效价的抗尖吻蝮蛇全毒抗血清。本专利技术采用的具体技术方案如下：一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法,其特征在于包括以下步骤：a、按照0.1g 尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、蛇毒蛋白的包埋 将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；c、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第四次注射后取血，6小时后离心获得抗血清。所述的尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法制得的抗血清。所述的抗血清在治疗尖吻蝮蛇咬伤患者上的应用。本专利技术技术效果体现在几个方面：1、保证被免疫动物健康存活由于出血活性被抑制，注射部位不会发生出血和坏死，因此，被注射动物不会因为抗原的副作用而死亡，保证了制备抗血清实验的成功。2、不使用昂贵的福氏佐剂，降低抗血清的生产成本本专利技术将蛇毒蛋白包埋在网状的聚丙烯酰胺凝胶中，蛇毒蛋白从网状的聚丙烯酰胺凝胶中缓慢释放到动物体内，用这种方法不但抗原在动物体内停留时间长，充分刺激免疫系统，而且用聚丙烯酰胺凝胶替代了昂贵的福氏佐剂。3、制备的抗血清效价高通过比较，本专利技术比传统方法制备的抗血清效价高出2.5倍，因此注射同等量的抗血清治疗效果大大提高，如果少注射抗血清，则可以降低异原血清对人体的副作用。具体实施方式实施例一：第一步：尖吻蝮蛇出血活性的抑制取5mL体积的干净塑料管，将0.1g 尖吻蝮蛇原溶解于2.0 mL 0.1M Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中，加50 mg Na2EDTA并充分溶解；第二步：蛇毒蛋白的包埋将上述无出血活性的溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %过硫酸铵、2uL四甲基乙二胺(TEMED)，充分混匀，沿试管壁缓慢加入0.5mL 异丙醇，1 h后凝固，去除异丙醇，取出胶体用手术刀评分成4份，每份约1 g，冷冻保存；第三步：注射免疫家兔，获得抗血清取1份上述胶体，加2.0 mL生理盐水，于研钵内充分磨细，吸入到5mL规格的一次性注射器中，总体积约3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次之间间隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL,腹腔注射2.25mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。第四步：抗血清效价的测定抗血清效价的测定与ELISA方法相似。将尖吻蝮蛇原毒用包被液（0.1mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液）配制成10μg/mL作为抗原样品，将待测抗血清进行倍比稀释，以不含尖吻蝮蛇毒的包被液代替抗原样品为空白，以未免疫的家兔血清替代待测抗血清作为阴性对照，用制备的抗血清作为一抗，羊抗兔IgG-碱性磷酸酶为二抗，1 mg/mL的p-NPP为底物，显色45分钟后在酶标仪上测定OD405值，以空白对照调零，待测抗血清的吸光值2倍于阴性血清吸光值的效价定为1，通过计算抗血清的稀释倍数计算未稀释前抗血清的效价。ELISA检测的大致步骤如下：（1）抗原包被：酶标板每孔加200μL包被抗原，酶标板置4oC冰箱过夜。（2）封闭：加封闭液，每孔200 μL ，37 oC孵育1 h。（3）加一抗：加入倍比稀释的抗血清（ELISA缓冲液稀释），阴性为未免疫的家兔血清， 37 oC孵育1 h。（4）加酶标二抗：所有酶标板孔加入1/10000的羊抗兔IgG-碱性磷酸酶（Sigma，ELISA缓冲液稀释），37 oC孵育1 h。（5）加底物：1 mg/mL的p-NPP（Sigma，溶于底物缓冲液，pH 9.8），37 oC黑暗中孵育30 min，测OD405值。经过计算，“实施例一”制备的抗血清效价达到510，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本专利技术制备的抗血清效价提高约2.5倍。实施例二：第一步：尖吻蝮蛇出血活性的抑制取5mL体积的干净塑料管，将0.09g 尖吻蝮蛇原溶解于1.8mL 0.1M Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中，加40mgNa2EDTA并充分溶解；第二步：蛇毒蛋白的包埋将第一步获得的无出血活性的溶液加入1.3mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uL TEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；第三步：注射免疫家兔,获得抗血清与“实施例一”第三步相同。第四步：抗血清效价的测定检测过程与“实施例一”第四步相同。经过计算，“实施例二”制备的抗血清效价达到550，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本专利技术制备的抗血清效价提高约2.6倍。实施例三：第一步：尖吻蝮蛇出血活性的抑制取5mL体积的干净塑料管，将0.11g 尖吻蝮蛇原溶解于2.2mL 0.1M Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液中，加60mgNa2EDTA并充分溶解；第二步：蛇毒蛋白的包埋将第一步获得的无出血活性的溶液加入1.5mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uL TEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；第三步：注射免疫家兔,获得抗血清与“实施例一”第三步相同。第四步：抗血清效价的测定抗血清效价的测定与ELISA方法相似。 检测过程与“实施例一”第四步相同。 经过计算，“实施例三”制备的抗血清效价达到510，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本专利技术制备的抗血清效价提高约2.5倍。 本专利技术用不同剂量的尖吻蝮蛇毒，采用Na2EDTA消除出血活性，聚丙烯酰胺凝胶包埋代替乳化，均获得稳定和满意的结果，说明该技术实用、可靠。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法,其特征在于包括以下步骤：a、按照0.1g 尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、蛇毒蛋白的包埋 将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；c、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清。
【技术特征摘要】
1.一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法,其特征在于包括以下步骤：a、按照0.1g 尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、蛇毒蛋白的包埋 将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦传宝，
申请(专利权)人：安徽威尔试剂盒科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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