本发明专利技术公开了重组腺相关病毒及其在治疗和预防心功能不全和心力衰竭中的应用。本发明专利技术公开的重组腺相关病毒表达Junctophilin‑2蛋白，Junctophilin‑2蛋白为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明专利技术的重组腺相关病毒对动物心功能不全和心力衰竭具有治疗作用，可以提高动物的心脏射血分数，可以用来治疗动物心功能不全和心力衰竭。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中重组腺相关病毒及其在治疗和预防心功能不全和心力衰竭中的应用。
技术介绍
心脏是人体最重要的器官之一，人们通常将它比作向全身输送新鲜有氧血液的泵。心肌细胞尤其是心室肌细胞持续不断地有规律的周期性收缩是泵行使功能的源动力。心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏泵功能障碍，以致心输出量减少，不足以适应全身组织代谢需要的一种病理过程。心力衰竭亦称泵衰竭(pump failure)。心力衰竭包括两种情况：①心肌衰竭(myocardial failure)：是指原发性心肌肌原纤维收缩功能障碍所致的心力衰竭，此时泵功能障碍是原发的。如心肌炎时，心肌的变质、渗出或结缔组织增生可使心肌收缩性明显减弱。又如心肌梗死时可因部分心肌坏死而致心肌收缩性减弱等等。②其他原因所致的心力衰竭：如心脏瓣膜病时，由于心肌负荷过重而发生心肌肥大和心脏扩大，继则心肌收缩性相对不足而导致心力衰竭，此时泵功能障碍是继发的，在除去瓣膜障碍时较易逆转。心功能不全(cardiac insufficiency)是由于各种原因造成心肌的收缩功能下降，使心脏前向性排血减少，造成血液淤滞在体循环或肺循环产生的症状。心功能不全可分为无症状和有症状两个阶段，前者有心室功能障碍的客观证据(如左室射血分数降低)，但无典型充血性心力衰竭症状，心功能尚属纽约心脏病学会(NY-HA)分级的I级，属有症状心力衰竭的前期，无症状心功能不全如不进行有效治疗，迟早会发展成有症状心功能不全。心脏射血分数(EF)，指的是每搏输出量占心室舒张末期容积量的百分比。正常的心脏射血分数左室射血分数(LVEF)为≥50％；右心室射血分数为≥40％。若小于此值即为心功能不全。心功能不全与心力衰竭本质上是相同的，只是在程度上有所区别：心力衰竭一般是指心功能不全的晚期，患者有明显的心力衰竭的临床症状，而心功能不全则指病情从轻到重的全过程，包括没有心力衰竭症状的心功能不全代偿阶段。Junctophilin-2蛋白是2000年由一位日本科学家首次报道发现，属于Junctophilin家族。Junctophilin家族的Junctophilin-1主要存在于骨骼肌中，另两种亚型Junctophlin-3以及Junctophilin-4主要分布于大脑中。通过序列比对和二级结构预测，发现Junctophilin家族蛋白的氨基端有8个序列保守的模式结构组成，羧基端是一段跨膜区域。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属于微小病毒科，无外包膜单链线状DNA病毒。天然的腺相关病毒基因组大小约4700bp,包括上下游两个开放读码框架，分别编码复制依赖蛋白Rep以及组配衣壳蛋白Cap，位于2个由145个核苷酸组成的反向末端重复序列(ITR)之间。腺相关病毒为复制缺陷型病毒，其复制依赖于腺病毒的早期蛋白E1A,E1B,E2A以及E4,VARNA等因子。目前主流的腺相关病毒包装系统由三个质粒组成，即pAAV-ITR，pAAV R/C和pAdDeltaF6。其中pAAV-ITR带有ITR序列和多克隆酶切位点，可以插入外源编码基因。pAAV R/C编码Rep蛋白和Cap蛋白，而pAdDeltaF6则提供腺相关病毒基因组复制所必须的腺病毒辅助因子E4以及VARNA。三质粒腺相关病毒包装系统所使用的HEK293细胞系则可提供E1A,E1B以及E2A这三种辅助因子。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防心功能不全或心力衰竭。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组腺相关病毒，其名称为AAV-JPH-2，AAV-JPH-2表达Junctophilin-2(JPH-2)蛋白。上述重组腺相关病毒中，Junctophilin-2可为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。其中，序列1由692个氨基酸组成。上述重组腺相关病毒中，AAV-JPH-2的基因组可包括下述1)、2)和3)：1)腺相关病毒的Rep编码基因与Cap编码基因；2)腺病毒的E4编码基因、VARNA编码基因、E1A编码基因、E1B编码基因与E2A编码基因；3)Junctophilin-2编码基因。上述重组腺相关病毒中，所述Rep编码基因与所述Cap编码基因均可来源于pAAV2/9。所述E4编码基因和所述VARNA编码基因均可来源于pAdDeltaF6。所述E1A编码基因、E1B编码基因与E2A编码基因均可来源于HEK293T细胞。上述重组腺相关病毒中，所述AAV-JPH-2的基因组也可仅由所述1)、所述2)和所述3)组成。上述重组腺相关病毒中，所述Junctophilin-2编码基因可为如下b1)或b2)或b3)所示的核酸分子：b1)编码序列是序列表中序列1的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码Junctophilin-2的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码Junctophilin-2的DNA分子。其中，序列2由2079个核苷酸组成，序列2所示的DNA分子(JPH-2基因)编码序列1所示的JPH-2。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了AAV-JPH-2的构建方法，所述方法包括将含有所述Rep编码基因的重组载体、含有所述Cap编码基因的重组载体、含有所述E4编码基因的重组载体、含有所述VARNA编码基因的重组载体和含有所述Junctophilin-2编码基因的重组载体导入包装细胞中，得到重组腺相关病毒；所述包装细胞含有所述E1A编码基因、所述E1B编码基因与所述E2A编码基因。上述方法中，所述包装细胞能表达E1A、E1B和E2A。所述包装细胞具体可为HEK293细胞，如HEK293T细胞。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一产品：P1、所述AAV-JPH-2的基因组；P2、含有所述Junctophilin-2编码基因的重组载体；P3、含有所述Junctophilin-2编码基因的表达盒。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码JPH-2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的JPH-2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码JPH-2且具有JPH-2功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述产品中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SD本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒表达Junctophilin‑2蛋白。
【技术特征摘要】
1.重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒表达Junctophilin-2蛋白。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于：Junctophilin-2为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒包括下述1)、2)和3)：1)腺相关病毒的Rep编码基因与Cap编码基因；2)腺病毒的E4编码基因、VARNA编码基因、E1A编码基因、E1B编码基因与E2A编码基因；3)Junctophilin-2编码基因。4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述Junctophilin-2编码基因为如下b1)或b2)或b3)所示的核酸分子：b1)编码序列是序列表中序列1的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码Junctophilin-2的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码Junctophilin-2的DNA分子。5.权利要求1-4中任一所述重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：所述方法包括将含有权利要求1-4中任一所述重组腺相关病毒中所述Rep编码基因的重组载体、含有所述Cap编码基因的重组载体、含有所述E4编码基因的重组载体、含有所述VARNA编码基因的重组载体和含有所述Junctophilin-2编码基因的重组载体导入包装细胞中，得到重组腺相关病毒；所述包装细胞含有权利要求1-4中任一所述重组腺相关病毒中所述E1A编码基因、所述E1B编码基因与所述E2A编码基因。6.下述任一产品：P1、权利要求1-4中任一所述重组腺相关病毒的基因组；P2、含有权利要求1-4中任一所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：项斌，王世强，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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