本发明专利技术公开了一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其中所述引物包括第一、第二引物对，所述探针包括第一、第二探针对，所述第一引物对包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示序列。本发明专利技术还公开了基于所述引物和探针的试剂、试剂盒等。本发明专利技术所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测MTHFR基因rs1801131、rs1801133位点突变，检测过程简单、耗时短，污染少，且所用的反应体系和反应条件稳定，检测结果可靠，灵敏性高，适于对体液样本进行高通量的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种冠心病遗传风险因子检测方法，特别涉及一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针、试剂盒及其应用，属于分子生物学和医学领域。
技术介绍
冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。大量的流行病学调查研究表明血浆同型半胱氨酸水平升高与动脉粥样硬化性血管疾病危险增加有关，且血浆同型半胱氨酸与动脉粥样硬化性血管疾病之间存在着一种强烈的剂量依赖关系，这种关系不依赖于传统的致动脉粥样硬化性血管疾病的危险因子。造成高半胱氨酸的原因基本上分为遗传性代谢和获得性代谢障碍两大类。其中遗传性代谢可归因于血浆同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶的基因突变，这会导致酶活性下降，使甲硫氨酸代谢障碍，导致血浆同型半胱氨酸在体内蓄积。目前研究中，MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半胱氨酸、叶酸代谢与许多疾病(Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等)相关。MTHFR为5，10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)，亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入 甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平，高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。现已发现MTHFR基因有多种突变类型，不同的基因突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响，表现出各种不同的酶活性和热稳定性。一般说来，涉及进化上保守序列的突变会引起酶活性的急剧下降，危害性比较大；相反，处于非保守序列的突变对酶的活性影响较小，危害性也较小。rs1801133为MTHFR基因中的一个SNP位点MTHFR C677T，是一个常见的不耐热错义突变。MTHFR基因第677位密码子C被T置换，从而使一个高度保守的丙氨酸变成了缬氨酸，同时产生了一个HInfI和TaqI限制性酶切位点。C677T位于MTHFR催化区域，该突变直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低。为实现对冠心病遗传风险因子的检测，研究人员发展出了多种方法，其中较为常见的一种方式是构建对应于这些风险因子的试剂盒，但是现有的此类试剂盒在应用时往往存在准确性较差等问题，且通量较低，难以进行实际应用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针、试剂盒及其应用，以克服现有技术中不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其中：所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。进一步的，所述第一引物对和第二引物对中各引物的末端还连接有荧光标记物，所述荧光标记物包括FAM或VIC。本专利技术实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂中的用途。本专利技术实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。本专利技术实施例还提供了一种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂，其包含所述的引物和探针。本专利技术实施例还提供了一种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒，其包含所述的引物和探针。进一步的，所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。本专利技术实施例还提供了所述的引物和探针、所述的试剂、或者所述的试剂盒于制备冠心病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。与现有技术相比较，本专利技术通过设计特异性的引物对和探针对，能实现对MTHFR基因中rs1801131、rs1801133位点进行快速、准确地检测，操作简单、成本低，结果精确，可以实现高通量检测，具有广泛应用前景。具体实施方式下面结合一些典型实施例进一步阐述本专利技术的技术方案。需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照Sambrook等人、分子克隆、实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等所述的条件，或按照厂商所建议的条件。在本专利技术的如下实施例主要提供了一种检测冠心病遗传风险因子的引物对、试剂、试剂盒等。更具体的说，如下实施例提供了一种检测MTHFR酶活性或者叶酸代谢能力的引物和探针、试剂、试剂盒，其涉及的基因位点主要为MTHFR基因中的rs1801131位点及rs1801133位点。其中，该MTHFR基因单核苷酸多态性位点rs1801131位点、rs1801133位点均与冠心病密切相关。而MTHFR基因的详细序列可参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。进一步的，本专利技术实施例提供的一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针中，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列其中，所述第一引物对对应于rs1801131位点，其包含的两条引物可分别命名为rs1801131-fp(SEQ ID NO.1)和rs1801131-rp(SEQ ID NO.2)。其中，所述第二引物对对应于rs1801133位点，其包含的两条引物可分别命名为rs1801133-fp(SEQ ID NO.3)和rs1801133-rp(SEQ ID NO.4)。其中，所述第一探针对对应于rs1801131位点，其包含的两条探针可分别命名为rs1801131-FAM(SEQ ID NO.5)和rs1801131-VIC(SEQ ID NO.6)。其中，所述第二探针对对应于rs1801133位点，其包含的两条探针可分别命名为rs1801133-FAM(SEQ ID NO.7)和rs1801133-VIC(SEQ ID NO.8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其特征在于：所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其特征在于：所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述第一引物对和第二引物对中各引物的末端还连接有荧光标记物，所述荧光标记物包括FAM或VIC。3.权利要求1或2所述的引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄迅威，
申请(专利权)人：苏州康吉诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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