一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法，所述方法，步骤如下：步骤一：将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；步骤二：取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；步骤三：每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；步骤四：定标品与检测试剂反应，以加入的结合物溶液的糖含量为横坐标，以反应值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤五：将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价结合物的糖含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物制品检测方法，具体涉及一种多价肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测方法。
技术介绍
在多价疫苗的质量控制中，对各组分的定量检测是重要的项目之一。目前，多价疫苗中各组分的定量检测方法包括：化学显色疫苗中某些组分在特定波长范围内具有光吸收，或经化学处理后，形成具有光吸收的物质，其光吸收程度与含量有相关关系，可用于含量检测。例如，A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中的C群多糖，唾液酸是其有效成分之一，采用间苯二酚对C群脑膜炎球菌多糖中唾液酸抽提后，在585nm处有最大吸光值。该法的局限性在于，大部分多价疫苗中的各组分化学性质相近，寻找针对其中一个组分的化学处理方法比较困难。色谱分析阴离子色谱法用于多种单糖、双糖、寡糖、多糖的分析。例如，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中的A群多糖，经酸水解处理后，产生6-磷酸甘露糖胺单体，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定其含量。该法的局限性在于，实现多价疫苗中各组分的基线分离困难，色谱条件复杂，对试剂和环境要求高。酶联免疫吸附双抗体夹心ELISA法常用于抗原的定量检测。A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物含量检测采用双抗体夹心定量ELISA法。此方法需要制备各群多糖特异性单抗作为捕获抗体。单抗制备成本较高，产量较低，很难适应规模化检测需要。免疫火箭电泳免疫火箭电泳通过参照已知浓度的多糖在相同凝胶中的迁移率,对待测的不同浓度的多糖的迁移速率进行线性回归分析,可以初步计算多糖含量。该法操作过程复杂，是粗略测定多糖含量的一种方法。速率比浊速率比浊法是一种免疫化学方法，用于多价疫苗各型特异性糖含量的检测。该方法以多糖作
为抗原，在抗体过量存在的条件下，形成抗原抗体复合物聚集体的速率与体系中存在的抗原量成一定的比例关系。利用该原理可检测混合物中某一多糖抗原的含量。速率比浊法操作简便快捷，自动化程度高，不同的多糖可采用相同参数设置进行检测，可适应规模化检测的需要。常规的特异性糖含量检测，采用标准曲线法，在抗原量充足的条件下，可以得到很好的检测结果，如23价肺炎球菌多糖疫苗各型特异性糖含量的检测即采用标准曲线法。但当抗原量较少，且反应体系成分较复杂时，容易造成反应灵敏度降低、检测结果波动较大的问题。多价肺炎球菌结合疫苗,如：七价肺炎球菌结合疫苗，包括7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，13价肺炎球菌结合疫苗等均为为已经上市的疫苗，其中每个型多糖含量远低于肺炎球菌多糖疫苗，而且含有铝佐剂成分，若采用标准曲线法，则检测效率降低，对检测试剂要求提高。若采用标准加入法，则可以有效地解决以上问题，并且以待检测的疫苗作为定标物质，消除了定标品与检品之间的成分差异，更具合理性。因此，肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量的检测采用标准加入法是非常有效的。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有的肺炎球菌结合疫苗各型特异性糖含量检测方法灵敏度低、检测结果波动大的问题，而提供一种肺炎球菌结合疫苗各型荚膜多糖蛋白结合物中多糖含量的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采取的策略为：以待测结合疫苗为定标品，通过梯度添加待测型别单价结合物的方式，获得测定曲线，进而获得待测物含量。多价肺炎球菌结合疫苗的组成为多种单价肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合物混合组成的疫苗，其中的肺炎球菌荚膜多糖为但不限于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F型肺炎球菌荚膜多糖,蛋白为载体蛋白，选自但不限于白喉类毒素、破伤风类毒素等。多糖和蛋白的结合采用但不限于CDAP法。多价肺炎球菌结合疫苗的效价是以肺炎球菌荚膜多糖的含量计算的，为对疫苗的效价进行评定，需要对肺炎球菌荚膜多糖的含量进行检测，而现有技术的检测方法存在多种缺陷。为此，本专利技术提供一种多价肺炎球菌结合疫苗中各型荚膜多糖的糖含量的检测方法，所述方法，步骤如下：步骤一：将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；步骤二：取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；步骤三：每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；步骤四：定标品与特异性血清反应，反应时间为1.5-10分钟，以加入的结合物溶液的糖含量为横坐标，以散射光增加值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤五：将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价结合物的糖含量；所述步骤二中，每份肺炎球菌结合疫苗加入单价荚膜多糖蛋白结合物的体积不大于总体积的10％。每份肺炎球菌结合疫苗的体积均不小于总体积的90％。每份样品用稀释液稀释至相同的体积，总体积不小于100μL。所述步骤三中，用于解吸附的碱为氢氧化钠，配制成0.1M-10M的水溶液，碱的用量是样品量的0.001-1倍。所述步骤三中，用于中和的酸为柠檬酸，配制成0.1M-5M的溶液，用酸调节pH值至检品初始pH值。所述步骤四中反应体系为：缓冲液体积为0-300μL，样品量为3-75μL、特异性血清量为3-235μL、反应时间为1.5-10分钟，所述缓冲液为：含有表面活性剂的磷酸缓冲生理盐水，其中磷酸缓冲生理盐水为0.01M-0.1M的溶液，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，配制成0.05％的溶液。本专利技术的方法，以欲测组份的纯物质为内标品，即以组成多价肺炎球菌结合疫苗的各型单价结合物为内标品。以经解吸附处理的检品和相应对照品的混合物为定标品，绘制标准曲线，即以肺炎球菌结合疫苗和各型单价结合物的混合物，经解吸附处理后制备为定标品，绘制标准曲线。本专利技术的方法，每个型别的糖含量检测取用的肺炎球菌结合疫苗不少于两份。本专利技术的方法，分别在若干份相同体积结合疫苗中加入不等量的对照品，且有一份结合疫苗中加入的对照品为零，以加入对照品的糖含量为横坐标，反应值为纵坐标，绘制标准曲线，用外推法(延长标准曲线和横坐标相交的数的绝对值)得到检品中对应单价结合物的糖含量。本专利技术的方法，所述步骤三中，用于解吸附的碱为碱性物质配制的溶液，选自无机碱或有机碱，可以采用一种碱或多种碱的混合物。无机碱是指碱金属及碱土金属的氢氧化物(包括氢氧化铵)，优选氢氧化钠，有机碱是指分子中含有氨基的有机化合物。所述氢氧化钠使用时配制成0.001M-26M的水溶液，优选0.1M-10M的水溶液。本专利技术的方法，所述步骤三中，用于中和的酸为含有EDTA、柠檬酸、氨基乙酸、氟离子和/或氯离子的酸溶液，优选柠檬酸溶液，使用时配制成0.001M-7M的溶液，优选0.1M-5M的溶液。本专利技术的方法，所述步骤三中，用于解吸附的碱的用量是样品量的0.001-1倍。本专利技术的方法，所述步骤三中，用酸中和是调节酸碱混合溶液pH值至检品初始pH值。本专利技术和现有技术相比，优点如下：适应复杂的反应体系，在抗原含量相对较低的情况下提高信噪比；对血清本底要求降低，简化血清纯化过程；消除定标品与检品之间的成分差异，检测手段更具合理性。以下通过实验数据说明本专利技术的优点：表1：2型肺炎球菌结合物标准曲线法和标准加入法定标比较如表所示：结合物糖含量较低时(2-4μg)，散射光增加值不明显，造成曲线平缓，若检品含量恰好在此范本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多价肺炎球菌结合疫苗中各型荚膜多糖的糖含量的检测方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：步骤一：将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；步骤二：取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；步骤三：每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；步骤四：定标品与特异性血清反应，反应时间为1.5‑10分钟，以加入的结合物溶液的糖含量为横坐标，以散射光增加值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤五：将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价结合物的糖含量。

【技术特征摘要】
1.一种多价肺炎球菌结合疫苗中各型荚膜多糖的糖含量的检测方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：步骤一：将各型单价荚膜多糖蛋白结合物按糖浓度配制成一定浓度的溶液；步骤二：取肺炎球菌结合疫苗，第一份不加步骤一的结合物溶液，从第二份开始，加入步骤一的结合物溶液，加入的体积依次递增，全部样品用溶剂稀释至同样体积；步骤三：每份中加入碱解吸附，再用酸中和，作为定标品；步骤四：定标品与特异性血清反应，反应时间为1.5-10分钟，以加入的结合物溶液的糖含量为横坐标，以散射光增加值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤五：将标准曲线外推至含量轴，在含量轴上的截距，即为肺炎球菌结合疫苗中单价结合物的糖含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，每份肺炎球菌结合疫苗加入单价荚膜多糖蛋白结合物的体积不大于总体积的10％。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，每份肺炎...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡月凤，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11