一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种包含特异结合人瘦素蛋白leptin的核酸适体的试剂盒。本发明专利技术提供的核酸适体，与人瘦素蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明专利技术的核酸适体，可以捕获溶液中的人瘦素蛋白，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明专利技术的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
格雷夫斯病(Graves' disease)是一种常见病，女性发病率为1/1000人/年。除甲状腺功能亢进以外，25-50％患有格雷夫斯病的个体病情发展到在临床上累及眼睛，即甲状腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves' Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲状腺眼病的典型形式。虽然一些GO患者只患有轻微的眼睛不适，但是3-5％患有剧烈疼痛和炎症伴有复视乃至视力丧失。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。近年来的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)对TAO患者眼眶前脂肪成纤维细胞增殖、移行以及细胞分化过程中细胞内脂质形成具有重要的作用。因此，检测人瘦素蛋白的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测人瘦素蛋白的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异结合leptin的核酸适体及其试剂盒。本专利技术提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。所述核酸适体与leptin蛋白具有较好的亲和能力。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。所述核酸适体可用于制备检测leptin的试剂盒。利用本专利技术的核酸适体，可以捕获血液中的leptin，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本专利技术的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获leptin进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本专利技术具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、核酸适体的筛选和制备设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39个随机核苷酸。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug leptin蛋白(利用CN100366738C公开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:1)leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:2)leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:3)leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:4)leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:5)leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:6)leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:7)leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:8)leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:9)leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQ ID NO:10)leptin-11：TAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于眼科疾病检测的试剂盒，其含有核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种用于眼科疾病检测的试剂盒，其含有核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID No：8所述。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，
申请(专利权)人：李倩，
类型：发明
国别省市：江苏;32