一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，本发明专利技术是利用重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切和DNA连接等方法将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等长度的小的DNA序列构建到一个质粒上。这种质粒经单一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七条亮度均一的条带。本发明专利技术用于制备DNA标准参照物，用于在琼脂糖电泳中指示DNA分子量的相对大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域中的一种不可或缺的电泳耗材，具体涉及一种小的脱氧核糖核酸(DNA)分子量标准物、小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒以及其制备方法。
技术介绍
DNA分子量标准物是一种用于指示DNA在琼脂糖电泳中泳动速度相对大小的试剂，是由已知的特定大小的多个DNA片段混合而成的。目前主要的制备方法有PCR扩增方法，质粒酶切方法或者两者相结合的方法。PCR方法是设计引物，用体外PCR扩增的方法获得特定大小的DNA片段，然后通过纯化和定量，再按照一定的质量比混合在一起制备而成。酶切方法是将不同大小的片段克隆在一个或几个质粒中，提取质粒并用限制性酶完全酶切后将这些片段混合在一起。王芳等(王芳等.DNA标准分子量参照物的制备《安徽农业科学》,2009,第15期(15):6903-6903)用PCR方法制备的多个片段混合在一起制备成的分子量标准。PCR方法过程比较麻烦，包括模板制备，引物设计、PCR扩增，PCR产物纯化、PCR产物定量和PCR产物混合。片段越多，整个过程就越复杂。另一个方面，由于多数用于DNA扩增的聚合酶具有核酸外切酶活性，很容易导致扩增片段的降解，PCR扩增的特异性和扩增缓冲液成分、扩增的模板量和引物的使用量等密切相关。一旦一个环节出现问题，PCR产物的非特性扩增，这种非特异性扩增得到的条带对DNA分子量标准会产生干扰作用，导致DNA分子量大小的误判。酶切方法制备DNA分子量标准物是目前DNA分子量标准物生产的发展趋势。DNA在噬菌体，大肠杆菌等微生物中的体内复制，然后提取DNA，用特定的限制性内切酶进行酶切。涉及的制备步骤只有提取和酶切两步，相对于PCR制备方法简单宜行。早期的酶切分子量标准物制备是通过用一个或两个限制性内切酶对已知序列的DNA进行酶切获得多条不同长度的DNA片段的混合物，如例如Lamda/HindIII分子量标准物。通过提取Lamda噬菌体的DNA,用HindIII限制性内切酶将DNA切成125bp，564bp，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp和23130bp等八个不同长度的的片段。该类分子量标准物的缺点之一是小片段和大片段的分子量的差异较大导致酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离后DNA条带亮度不均匀。缺点之二是片段长度不是整倍数，不便于记忆。韦柳静等(韦柳静等.一种新型可用于DNA分子量标准的质粒构建《生物技术》,2004,05期(5):33-35)制备的DNA分子量标准物中含有2000bp，1500bp，1000bp,750bp,500bp和250bp
等六个片段，在片段长度上实现了整倍数，但是每个片段只有一个拷贝，2000bp和250bp片段长度相差八倍，亮度相差八倍，在凝胶电泳上指示效果不均一，而且这个分子量标准物中没有100bp片段。同样，王文华等(王文华等.一种简便的DNA定量分子量标准的制备《生物技术》,2010,第3期(3):62-64)通过定点突变制备的含有由100bp，200bp，400bp，800bp和1200bp等5个片段的分子量标准物也存在片段在凝胶中亮度不均一的现象。这个分子量标准物中1200bp片段的分子量为100bp片段的12倍，当100bp片段为10ng时，1200bp片段为120ng，电泳后观察到100bp片段亮度过弱，而1200bp片段亮度过强。James等(James.et al.genetic reagents for generating plasmids containing multiple copies of DNA segments.US Patent 4，403，036)专利技术的一个123bp小分子的DNA标准通过不完全酶切获得，组成的DNA条带是123bp长度的整倍数，但是该分子量标准物保留了2800bp长度大小的载体DNA，电泳效果中感觉2800bp条带非常强，与最小的123bp条带亮度反差特别大。这个分子量标准物是通过不完全酶切的方法制备的。不完全酶切的时间不易控制，一旦酶切时间够长，那么会缺少多个条带，不同批次的质粒用不同批次的酶酶切的时间是限制生产量和提高质量的关键。小分子的DNA分子量标准物质粒更不容易构建。总之，越来越多的生物技术和基因工程实验及研究中需要使用PCR技术。PCR扩增产物通常是通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测的，为了判定扩增产物的大小，通常为使用DNA分子量标准物作为电泳的参照物。不同的DNA分子量标准物广泛地应用于凝胶电泳中。目前小分子DNA标准物通常为PCR产物混合物，稳定性不好，目前的小分子DNA标准存在的问题。PCR方法过程比较麻烦，包括模板制备，引物设计、PCR扩增，PCR产物纯化、PCR产物定量和PCR产物混合。片段越多，整个过程就越复杂。而且保存过程中容易降解。其它的酶切分子量标准物，由于克隆的片段较为单一，每种片段均为一个拷贝，电泳后，条带的亮度有弱有强，亮度不均一。这些分子量标准物在生产制备和使用过程中都会产生很多的问题。然而，鉴定性质的PCR扩增的PCR产物长度通常在100-600bp之间，需求量大。但由于DNA片段太小，市场上商品化的小于700bp大小的质粒酶切小分子DNA分子量标准很少见，未见将所有的7个片段构建在单一质粒上的分子量标准物。这种质粒的构建方法在国际国内的专业杂志及专利中未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，其克服了
技术介绍
中提到的现有技术中的不足。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为若干长短不同的小的脱氧核糖核酸序列，其均为不大于1000bp的片段，且所述小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。一般而言，所述序列或片段至少为7个片段，所述片段均为100bp片段的整数倍。进一步地，所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物为小的脱氧核糖核酸序列，所述小的脱氧核糖核酸序列包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp的片段，所述小的脱氧核糖核酸序列均构建于同一个载体上。更进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列包括十个100bp、三个200bp、两个300bp、两个400bp、一个500bp、一个600bp以及一个700bp的片段。进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列还可包括800bp或/和900bp等长度的片段。进一步地，所述小的脱氧核糖核酸序列(即小的脱氧核糖核酸分子量标准物)是通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至一个所述载体上。该载体优选质粒，更优选为质粒PUC19。一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，该质粒为首尾连接的环状结构，所述质粒包括质粒骨架和小的脱氧核糖核酸序列，在所述小的脱氧核糖核酸序列内部设有酶切位点；所述小的脱氧核糖核酸序列包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp的片段；所述酶切位点包括EcoRI、BamH I、HindⅢ、SalI以及XbaI。进一步优选地，所述小的脱氧核糖核酸序列包括十个100bp、三个200bp、两个300本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，其特征在于：所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物包括至少7条小的脱氧核糖核酸序列，其均为不大于1000bp的片段，且所有片段均为100bp的整倍数；所有所述片段均构建于同一个载体上。

【技术特征摘要】
1.一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物，其特征在于：所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物包括至少7条小的脱氧核糖核酸序列，其均为不大于1000bp的片段，且所有片段均为100bp的整倍数；所有所述片段均构建于同一个载体上。2.根据权利要求1所述的小的脱氧核糖核酸分子量标准物，其特征在于：所述小的脱氧核糖核酸分子量标准物包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp长度的脱氧核糖核酸序列；该脱氧核糖核酸序列通过重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切法和脱氧核糖核酸连接法构建至同一个载体上。3.一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，该质粒为环状结构，其特征在于：所述标准物质粒包括质粒骨架和小的脱氧核糖核酸序列，在所述小的脱氧核糖核酸序列内部设有酶切位点；所述小的脱氧核糖核酸序列包括100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp的片段；所述酶切位点包括EcoRI、BamH I、HindⅢ、SalI以及XbaI。4.根据权利要求3所述的小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，其特征在于：所述小的脱氧核糖核酸序列包括10个100bp、3个200bp、2个300bp、2个400bp、1个500bp、1个600bp以及1个700bp的片段。5.根据权利要求4所述的小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，其特征在于：所述酶切位点还包括Xho I以及Bgl II，所述XhoI和SalI为同尾酶，BglII和BamHI为同尾酶。6.根据权利要求5所述的小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，其特征在于：所述小的脱氧核糖核酸序列以及酶切位点在环状的质粒骨架上的连接顺序依次为：BamHI-EcoRI-200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI-XbaI-HindⅢ-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-HindⅢ-500bp-EcoRI-600bp-EcoRI-400bp-EcoRI-700bp-SalI-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-SalI，成为环状的小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒。7.根据权利要求6所述的小的脱氧核糖核酸分子量标准物质粒，其特征在于：该标准物质粒能够被EcoRI完全酶切。8.一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(一)分子量标准物质粒的构建方法：Step 1：M1A的构建：①以pUC19为模板，设计4对PCR引物，分别扩增出500bp、600bp、400bp和700bp的DNA条带；②加入两端引物，通过重叠PCR的方法将①中的四个片段拼接在一起，成为DNA长片段，并在DNA长片段两端引入BamHI酶切位点；③以质粒PUC19为骨架质粒，BamHI酶切DNA长片段和骨架质粒，并将DNA长片段连接在骨架质粒上，即为M1A质粒；Step 2：M1B质粒的构建：①以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的染色体DNA为模板，该模板的DNA序列中只有一个EcoRI酶切位点；②设计引物进行PCR扩增，所述引物的5’端带有HindIII和EcoRI酶切位点，根据引物扩增一400bp长度的DNA片段；所述400bp长度的DNA片段经EcoRI单酶切后能够获得两个200bp的片段；③HindIII单酶切400bp长度的DNA片段和M1A质粒，并将二者连接在一起，即为M1B质粒；Step ...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐建国，吴立群，
申请(专利权)人：北京博迈德基因工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11