本发明专利技术公开了一种检测植物水提物体外抗炎活性的方法，该方法将现有技术中常忽略的水提物背景作为一个重要的检测因素，克服了目前活体动物实验和细胞实验存在的周期较长、操作繁琐、花费较高、干扰因素较多以及细胞实验不能直接独立表征抗炎活性等缺陷，具有简单、直接、快速、结果稳定、花费较低等优点，尤其适用于多种水提物的初筛工作，整个检测过程可在1小时内完成。基于本发明专利技术的检测方法，可进一步实现对植物水提物中的抗炎活性成分做到精准定量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物水提物活性检测
，具体涉及桂枝等18种植物水提物的抗炎活性检测方法
技术介绍
炎症是机体血管系统的活体组织对损伤因子的防御反应，是由损伤因子引起的组织损伤。目前，研究抗炎活性的植物水提取物实验方法主要有两种：一种是活体动物实验，常通过某种炎性介质制备动物炎症模型，然后通过检测炎症部位的重量或容积及炎症组织中的前列腺素E2、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)等指标变化判断植物水提物的抗炎活性，常用的如小鼠耳肿胀模型和大鼠足爪肿胀模型；另一种是细胞实验，多采用LPS刺激小鼠巨噬细胞，通过细胞培养后检测炎性因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)等在mRNA或蛋白水平的表达变化，考察植物水提物是否具有抗炎活性。上述两种方法均存在实验周期长、操作繁琐、花费较高以及不能直接独立表征抗炎活性等缺陷，特别是不适合大批植物水提物的初筛工作。脂肪氧合酶(LOX)又叫脂肪加氧酶、脂氧化酶，属于氧化还原酶，能专一催化含顺，顺－戊二烯结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物。在植物中，其天然底物主要是亚油酸。在动物体内，LOX主要存在于白细胞、肥大细胞、肺细胞和血小板中。在白细胞中，LOX是白三烯生物合成中的关键酶。通过催化细胞膜成分花生四烯酸氧化为氢过氧化酯酸，而后此化合物脱水转化为白三烯。而白三烯正是一类重要的炎性介质，是导致上下呼吸道炎症病变的重要因素。因此，可通过检测植物水提物对LOX活性的抑制程度考察其抗炎活性。目前，在研究单一化合物作为抑制剂对LOX活性的影响时，多采用分光光度计检测法。其检测原理为：LOX催化底物亚油酸反应生成的初期产物具有共轭二烯的结构，而共轭双键在234nm处有特征吸收，通过测定反应体系在此波长处的吸光度可以量化生成的共轭二烯量，并推算出酶活力。此方法显著优点是：简单、快速、可连续测定，但要求测定体系不能有浊度。而植物水提物不同于单一的化合物，成分复杂，色泽深浅不一，特别是容易产生浊度，因此上述常规检测方法不适用于植物水提物的检测，需对检测方法进行改进和优化。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对现有抗炎活性检测方法的不足，提供一种检测植物水提物的体外抗炎活性的方法以及一种具有较强抗炎活性的植物水提物。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测植物水提物体外抗炎活性的方法，该方法包括以下步骤：(1)植物提取液的制备：将植物原料经研磨粉碎后过40目筛，按料水的质量体积比1：20放入密闭容器，在80℃、静置条件下提取6h后，中性滤纸过滤后收集滤液，60℃浓缩至0.5mg/ul生药浓度，获得植物提取液。(2)制备以下反应液：a：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul 5-LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液a；b：取1ul蒸馏水加入含有30ul 5-LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液b；c：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul蒸馏水的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液c；d：取1ul蒸馏水加入含有30ul 5-LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入500ul终止液终止反应，然后加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul蒸馏水，得到反应液d；所述5-LOX稀释液由1体积的5-LOX与50体积的蒸馏水组成，所述底物为含亚油酸0.54mL/L的硼酸缓冲液，所述终止液为无水乙醇；(3)将步骤(2)制备的各反应液分别放置离心机中以3000rpm速度离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)中制备的各个上清液以每孔200ul的体积加入至96孔酶标板中，在酶标仪上选取234nm波长检测反应液的吸光度OD值。(5)如步骤(4)中的OD值超过酶标仪检测范围，将植物提取液的浓度稀释10倍(体积比)后，再按照上述步骤(1)、(2)、(3)和(4)依次操作。(6)植物水提物的抗炎活性以抑制率表示，抑制率计算公式如下：抑制率越高，植物水提物体外抗炎活性越强。当抑制率为负值时，可视为无抗炎活性。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本专利技术克服了目前活体动物实验和细胞实验存在的周期较长、操作繁琐、花费较高、干扰因素较多以及细胞实验不能直接独立表征抗炎活性等缺陷，具有简单、直接、快速、结果稳定、花费较低等优点，尤其适用于多种水提物的初筛工作，整个检测过程可在1小时内完成。基于本专利技术的检测方法，可进一步实现对植物水提物中的抗炎活性成分做到精准定量。附图说明图1为厚朴水提物浓度与5-LOX抑制率的标准曲线；图2为槲皮素浓度与5-LOX抑制率的标准曲线。具体实施方式本专利技术公开一种检测植物水提物体外抗炎活性的方法，该方法是通过检测植物水提物对5-LOX活性的抑制程度实现的。主要是通过分光光度计法检测植物水提物与5-LOX催化底物亚油酸反应生成的共轭二烯量在234nm处的吸光度值，推算出酶活力。下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：本实施例检测桂枝、香附子、茵陈蒿、女贞子、淫羊藿、肉桂等18种植物提取液的抗炎活性，包括以下步骤：(1)植物提取液的制备、定容：将桂枝、香附子、茵陈蒿、女贞子、淫羊藿、肉桂等18种植物原料经研磨粉碎后过40目筛，分别按料水的质量体积比1：20放入三角瓶内，在封闭、80℃、静置条件下提取6h后，中性滤纸过滤后收集滤液，60℃浓缩至0.5mg/ul生药浓度。(2)底物的制备：将吐温20以0.5mL/L的浓度分散于0.2mol/L的硼酸缓冲液中，再以0.54mL/L的浓度加入亚油酸(所用亚油酸纯度须>99％)，充分混匀后，用1mol/L的氢氧化钠调节缓冲液pH值为9.0，定容、备用。(3)反应液的制备、定容a(抑制后酶活)－取1ul步骤(1)所得的待测液加入至经蒸馏水稀释50倍的5-LOX液30ul于1.5ml dorf管，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水混匀待测；b(完全酶活)—以1ul蒸馏水替代步骤(1)所得待测液，完全重复上述操作步骤，此步骤是为了测得酶和底物完全反应时的吸光度；c(水提物背景)-取1ul步骤(1)所得待测液，以30ul蒸馏水取代5-LOX液，完全重复上述操作步骤，此步骤是为了测得在无5-LOX时，植物水提物与底物反应的背景吸光度值；d(完全失活)－以1ul蒸馏水替代步骤(1)所得待测液，在加底物之前先加入500ul终止液终止反应，其余步骤同上，此步骤是为了测得酶完全失活时的吸光度本底值。(3)将步骤(2)制备的各待测液放置离心机中以3000rpm速度离心5min，该步骤是为了消除植物水提液中的浊度对吸光度的影响。(4)将步骤(3)中制备的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测植物水提物体外抗炎活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)植物提取液的制备：将植物原料经研磨粉碎后过40目筛，按料水的质量体积比1：20放入密闭容器，在80℃、静置条件下提取6h后，中性滤纸过滤后收集滤液，60℃浓缩至0.5mg/ul生药浓度，获得植物提取液。(2)制备以下反应液：a：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul 5‑LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液a；b：取1ul蒸馏水加入含有30ul 5‑LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液b；c：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul蒸馏水的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液c；d：取1ul蒸馏水加入含有30ul 5‑LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入500ul终止液终止反应，然后加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul蒸馏水，得到反应液d；所述5‑LOX稀释液由1体积的5‑LOX与50体积的蒸馏水组成，所述底物为含亚油酸0.54mL/L的硼酸缓冲液，所述终止液为无水乙醇；(3)将步骤(2)制备的各反应液分别放置离心机中以3000rpm速度离心5min，获得上清液；(4)将步骤(3)中制备的各个上清液以每孔200ul的体积加入至96孔酶标板中，在酶标仪上选取234nm波长检测反应液的吸光度OD值。(5)如步骤(4)中的OD值超过酶标仪检测范围，将植物提取液的浓度稀释10倍(体积比)后，再按照上述步骤(1)、(2)、(3)和(4)依次操作。(6)植物水提物的抗炎活性以抑制率表示，抑制率计算公式如下：抑制率越高，植物水提物体外抗炎活性越强。当抑制率为负值时，可视为无抗炎活性。...
【技术特征摘要】
1.一种检测植物水提物体外抗炎活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)植物提取液的制备：将植物原料经研磨粉碎后过40目筛，按料水的质量体积比1：20放入密闭容器，在80℃、静置条件下提取6h后，中性滤纸过滤后收集滤液，60℃浓缩至0.5mg/ul生药浓度，获得植物提取液。(2)制备以下反应液：a：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul 5-LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液a；b：取1ul蒸馏水加入含有30ul 5-LOX稀释液的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500ul终止液终止反应，加入500ul蒸馏水，得到反应液b；c：取1ul步骤(1)所得的植物提取液加入含有30ul蒸馏水的1.5ml dorf管中，30℃孵育30min后，加入200ul底物，30℃反应3min，加入500u...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶新，徐子伟，吴宛澐，门小明，孙雨晴，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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