本发明专利技术涉及一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，属于液体乳分析技术领域。本发明专利技术中，试样采用乙酸水溶液进行提取，乙腈沉淀蛋白并稀释，Acquity UPLC BEH HILIC（100mm×2.1mm i.d.，粒径1.7 μm）分离，电喷雾离子源多反应监测（MRM）模式串联质谱进行测定。本发明专利技术优化了提取溶剂、提取时间、净化方式和仪器测定条件等。结果表明：三聚氰胺在0.02 ng/mL‑20 ng/mL，舒巴坦在 0.05 ng/mL‑100 ng/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.99。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在82.5%‑103.5%之间，相对标准偏差（RSD n=6）在0.9 %‑5.1%之间，三聚氰胺和舒巴坦的方法定量限分别为10 µg/kg和1.0 µg/kg。本发明专利技术前处理操作简单快捷，亲水作用色谱‑串联质谱法检测灵敏度高，定性定量准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，属于液体乳分析
技术介绍
三聚氰胺学名三氨三嗪，别名蜜胺，是一种重要的含氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味，常用于生产塑料、胶水、阻燃剂和化肥。蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量约为66%。通用的蛋白质测试方法凯氏定氮法是通过测定含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得液体乳中蛋白质测试含量偏高。长期摄入三聚氰胺会造成生殖和泌尿系统的损害，膀胱和肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。目前报道的食品或饲料中三聚氰胺的检测方法主要有液相色谱法、液质联用法、气质联用法、酶联免疫法等，测定复杂基质的食品中三聚氰胺均需经过固相萃取净化或衍生化，操作繁琐。2008年10月7日发布国家标准 GB/T 22388 -2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 》，确定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法和气相色谱-质谱联用法作为三聚氰胺的 3种测定方法。3种方法均使用固相萃取柱对样品进行净化，操作步骤相对比较繁琐，前处理时间长。尤其GC-MS(或GC-MS/MS)净化后还需要进一步衍生化。同年10月15日质检总局发布国家标准 GB/T 22400 -2008 《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》，该标准只针对原料奶和不含添加物的液态奶，采用乙腈作为样品的蛋白沉淀剂和三聚氰胺提取剂，磷酸盐为流动相，强阳离子交换色谱柱进行液相色谱分离测定。磷酸盐使用后需要长时间冲洗色谱系统，否则遇到高比例有机相磷酸盐就会析出，造成单向阀堵塞及其他部件的磨损，缩短仪器使用寿命。舒巴坦是一种竞争性不可逆的β-内酰胺酶抑制剂，对青霉素酶和头孢菌素酶有强的不可逆的抑制作用。舒巴坦对于β-内酰胺类抗生素有增效作用，医学上用舒巴坦与氨苄西林或头孢哌酮联合治疗敏感细菌所致的呼吸道、尿路感染等疾病。舒巴坦可能引起过敏反应，可透过胎盘到达胎儿，乳汁中亦可检出舒巴坦，虽其在孕妇、乳妇的应用尚无问题发生的报告，但应用时仍须权衡利弊。牛奶中残存抗生素药物问题受到普遍关注。β-内酰胺类抗生素是医学和兽医上的一类重要的抗菌药物, 应用十分广泛。许多国家都对该类药物在动物上的使用以及在动物源性食品中的残留进行了严格监控。有关抗生素残留的检测方法日趋完善，于是一些不法分子为了逃避抗生素的检测，向牛奶内添加β-内酰胺酶（β-lactamase），可以使β-内酰胺类抗生素如常用的青霉素降解，使微生物法、酶联免疫法等常规的检测方法失效，从而无法正确判断是否为“无抗奶”，掩盖抗生素超标的事实。而舒巴坦不可逆的与β-内酰胺酶结合，使溶液中游离的酶减少甚至为零，无法用现有的方法有效检测，纵容了抗生素滥用及非食用物质β-内酰胺酶的违法添加行为，严重威胁消费者的身体健康。2011年以来，舒巴坦就被列入国家风险监控项目，但至今未发布国家标准。现有测定舒巴坦的方法包括高效液相色谱法、液-质联用法、分光光度法、褶合光谱法和旋光法等。其中，液相色谱法和液-质联用法是应用最多的方法。液体奶中三聚氰胺的检验属于出厂前每批次都必须检验的项目，检验工作量大。舒巴坦被列入国家风险检测项目后，乳品企业也加强了对舒巴坦的检验。因此，液体乳中三聚氰胺和舒巴坦往往需要同时检验，而现有检测方法需要进行两次检验才能完成。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能同时测定液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法。本专利技术的检测方法能用于大批量液体乳样品的快速检测，将大大提高液体乳中三聚氰胺和舒巴坦这两种非法添加物的检测效率，降低乳品企业和检验机构的检测成本。技术方案一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，包括以下步骤：（1）前处理制备试样：称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL乙酸溶液，超声提取15min，取出放至室温后用乙酸溶液定容至25mL，混合均匀；从比色管中取1mL样品提取液，置于5 mL刻度管中，用乙腈定容至5 mL，涡旋混合1min，静置，用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，收集滤液为试样；所述乙酸溶液为质量浓度为2%的乙酸溶液；制备标准工作溶液：将三聚氰胺和舒巴坦的标准储备液用不含目标待测物的液体乳基质溶液配制梯度标准工作溶液；所述三聚氰胺标准储备液：以体积比为1:1的甲醇-水溶液为溶剂，浓度为0.2mg/mL；所述舒巴坦标准储备溶液：以超纯水为溶剂，浓度为1mg/mL；（2）获得标准质量色谱图、回归方程梯度标准工作溶液用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得标准质量色谱图；以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中三聚氰胺、舒巴坦的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；（3）定性分析试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有三聚氰胺或/和舒巴坦；（4）定量计算采用外标法定量：根据试样质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用步骤（2）的回归方程，计算得到三聚氰胺或/和舒巴坦的浓度；（5）超高效液相色谱-串联质谱联用仪的仪器的参数如下：液相色谱参数：色谱柱：Acquity UPLC BEH HILIC，柱长100mm，柱内径2.1mm ，填料粒径1.7 μm；流动相：A：10 mmoL/L的乙酸铵溶液，B：乙腈；梯度洗脱，梯度条件见表A，柱温：40℃，进样体积：2μL；表A 液相色谱梯度条件时间/min流速/mL/minA/%B/%梯度变化曲线00.3559564.00.35158564.50.35406065.50.35604065.60.3559568.00.355956“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线；质谱参数：离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压：3.2kV；离子源温度：150℃；雾化温度：450℃；锥孔气流速：50L/h；雾化气流速：800L/h；碰撞室压力：3.6×10-3 mPa；其他质谱参数见表B；表B 其他质谱参数本专利技术建立了同时测定液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。试样采用乙酸水溶液进行提取，乙腈沉淀蛋白并稀释，Acquity UPLC BEH HILIC（100mm×2.1mm i.d.，粒径1.7 μm）分离，电喷雾离子源多反应监测（MRM）模式串联质谱进行测定。本文考察和优化了提取溶剂、提取时间、净化方式和仪器测定条件等。结果表明：三聚氰胺在0.02 ng/mL-20 ng/mL，舒巴坦在 0.05 ng/mL-100 ng/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.99。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在82.5%-103.5%之间，相对标准偏差（RSD n=6）在0.9 %-5.1%之间，三聚氰胺和舒巴坦的方法定量限分别为10 µg/kg和1.0 µg/kg。本专利技术前处理操作简单快捷，亲水作用色谱-串联质谱法检测灵敏度高，定性定量准确。本专利技术能极大提高液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的检测效率，降低检测成本。有益效果（1）提高检测效率GB/T 22388 -2008国家标准液相色谱-串联质谱法检测三聚氰胺所需检验周期约为14本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，包括以下步骤：（1）前处理制备试样：称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL乙酸溶液，超声提取15min，取出放至室温后用乙酸溶液定容至25mL，混合均匀；从比色管中取1mL样品提取液，置于5 mL刻度管中，用乙腈定容至5 mL，涡旋混合1min，静置，用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，收集滤液为试样；所述乙酸溶液为质量浓度为2%的乙酸溶液；制备标准工作溶液：将三聚氰胺和舒巴坦的标准储备液用不含目标待测物的液体乳基质溶液配制梯度标准工作溶液；所述三聚氰胺标准储备液：以体积比为1:1的甲醇‑水溶液为溶剂，浓度为0.2mg/mL；所述舒巴坦标准储备溶液：以超纯水为溶剂，浓度为1mg/mL；（2）获得标准质量色谱图、回归方程梯度标准工作溶液用超高效液相色谱‑串联质谱联用仪进行检测，获得标准质量色谱图；以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中三聚氰胺、舒巴坦的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；（3）定性分析试样用超高效液相色谱‑串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有三聚氰胺或/和舒巴坦；（4）定量计算采用外标法定量：根据试样质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用步骤（2）的回归方程，计算得到三聚氰胺或/和舒巴坦的浓度；（5）超高效液相色谱‑串联质谱联用仪的仪器的参数如下：液相色谱参数：色谱柱：Acquity UPLC BEH HILIC，柱长100mm，柱内径2.1mm ，填料粒径1.7 μm；流动相：A：10 mmoL/L的乙酸铵溶液，B：乙腈；梯度洗脱，梯度条件见表A，柱温：40℃，进样体积：2μL；表A 液相色谱梯度条件时间/min流速/mL/minA/%B/%梯度变化曲线00.3559564.00.35158564.50.35406065.50.35604065.60.3559568.00.355956“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线；质谱参数：离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压：3.2kV；离子源温度：150℃；雾化温度：450℃；锥孔气流速：50L/h；雾化气流速：800L/h；碰撞室压力：3.6×10‑3 mPa；其他质谱参数见表B；表B 其他质谱参数。...
【技术特征摘要】
1.一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，包括以下步骤：（1）前处理制备试样：称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL乙酸溶液，超声提取15min，取出放至室温后用乙酸溶液定容至25mL，混合均匀；从比色管中取1mL样品提取液，置于5 mL刻度管中，用乙腈定容至5 mL，涡旋混合1min，静置，用0.22μm有机微孔滤膜过滤后，收集滤液为试样；所述乙酸溶液为质量浓度为2%的乙酸溶液；制备标准工作溶液：将三聚氰胺和舒巴坦的标准储备液用不含目标待测物的液体乳基质溶液配制梯度标准工作溶液；所述三聚氰胺标准储备液：以体积比为1:1的甲醇-水溶液为溶剂，浓度为0.2mg/mL；所述舒巴坦标准储备溶液：以超纯水为溶剂，浓度为1mg/mL；（2）获得标准质量色谱图、回归方程梯度标准工作溶液用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得标准质量色谱图；以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中三聚氰胺、舒巴坦的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；（3）定性分析试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛霞，郑红，王骏，刘艳明，宿书芳，公丕学，张艳侠，祝建华，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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