免疫刺激性质粒制造技术

本发明专利技术涉及免疫调节剂组合物和使用方法以及制备方法。所述免疫调节剂组合物包含能够引发受体个体中的免疫应答的免疫刺激性质粒或DNA序列。另外，所述免疫刺激性质粒或DNA序列不含抗生素抗性编码序列以帮助降低群体中抗生素抗性的水平转移的可能性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术总体涉及免疫刺激性质粒。所述质粒不包含抗生素抗性基因。所述质粒可以包含不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因(例如，lacZ基因)。或者，所述质粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。专利技术背景与脊椎动物DNA中相比，非甲基化的CpG基序频繁得多地存在于细菌DNA中。这些基序激活宿主防御机制，并且导致固有和获得性免疫应答。CpG基序及其免疫刺激作用综述于Krieg, Ann. Rev. Immunol. 20:709–760 (2002)。先前开发了含有许多CpG基序的免疫刺激性质粒，并且已经证明，当以包含该质粒和阳离子脂质体递送媒介物的免疫调节剂组合物的形式施用于禽类和牛科动物物种时，有效地引发免疫应答是有效的。参见美国专利申请公开号2012/0064151 A1(禽类物种)和2013/0295167 A1(牛科动物物种)，其两者的内容以其整体通过引用并入本文。该质粒，pMB75.6，长度为4242 bp，并且含有288个CpG二核苷酸。pMB75.6的图谱示于图1中，并且pMB75.6的核苷酸序列提供为SEQ ID NO: 2。如美国专利申请公开号2012/0064151中所述，含有pMB75.6的免疫调节剂组合物当卵内施用时引发非抗原特异性免疫应答，其保护鸡免于感染性疾病。至少一种生物试剂诸如疫苗的施用进一步增强该非抗原特异性免疫应答。此外，发现含有pMB75.6质粒的免疫调节剂组合物具有佐剂作用并引发疫苗效力的增加。类似地，如美国专利申请号2013/0295167中所述，含有pMB75.6的免疫调节剂组合物在牛中引发非抗原特异性免疫应答，其保护牛免于感染性疾病。然而，如图1中所示，pMB75.6质粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)。由于关于抗生素抗性基因水平转移至环境中的细菌的担忧，基于抗生素的选择和生产系统变得越来越不受欢迎。对于直接施用于个体的载体(例如，用于基因疗法或DNA疫苗接种的免疫刺激性质粒诸如pMB75.6或载体)，抗生素抗性基因的潜在水平转移特别使人担忧。因此，本领域中需要能够在个体中引发免疫应答、同时也缺乏抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒。专利技术概述本专利技术涉及免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒可以包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4或其组合的序列具有至少89％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO: 1的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO: 4的序列。在其它方面，所述免疫刺激性质粒可以由与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4或其组合的序列具有至少89％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO: 1的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO: 4的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在其它方面，所述免疫刺激性质粒包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记物的核酸序列。本专利技术还涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以及药学上可接受的载体的药物制剂。本专利技术还涉及包含阳离子脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种的免疫调节剂组合物。在一些方面，本专利技术涉及使用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列的方法。合适的使用方法包括对个体进行治疗性施用。此类治疗性施用包括对一个或多个个体的预防性治疗、整体预防性治疗和感染后治疗。本专利技术涉及刺激或引发个体中的免疫应答的方法。在一些方面，所述方法包括通过向个体施用本文所述的免疫调节剂组合物而刺激该个体中的免疫应答。在一些方面，所述方法包括通过向个体施用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列而刺激该个体中的免疫应答。其它目标和特征将是一部分显而易见的，而一部分在下文中指出。附图简述以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本专利技术的某些方面。本专利技术可以通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述而更好地理解。图1显示pMB75.6质粒的图谱；图2显示pGCMB75.6质粒的图谱；图3显示pLacZ75.6质粒的图谱；而，图4图示说明本文所述的免疫调节剂组合物提高了用致病病毒攻击的受体个体的存活率(图4A和图4B)。专利技术详述根据本专利技术，已经发现了能够引发受体个体中的免疫应答的组合物，以及使用方法。具体而言，本专利技术涉及新型核酸组合物或免疫调节剂组合物及其用途。已经发现，此类免疫调节剂组合物可以包含本文所述的具有提高的GC含量、CpG基序且在不包含抗生素抗性基因或编码序列的情况下增殖的DNA序列。本专利技术的核酸序列可用于刺激或增强个体中的免疫应答以预防或治疗感染性疾病，其与本领域中已知的其它预防和治疗方法相比具有显著提高的安全性。本专利技术尤其可用于治疗和预防由微生物引起的感染性疾病，所述微生物诸如，但不限于，病毒、细菌、霉菌、真菌、酵母、寄生虫和本领域中已知的其它微生物。下面更详细讨论了所述免疫调节剂组合物的组成及使用方法。I. 组合物可用于本专利技术中的组合物，诸如本文所述的那些，通常能够用作针对感染性疾病的预防性疗法、整体预防性疗法或治疗疗法。此类组合物在本文中被称为免疫调节剂组合物。所述免疫调节剂组合物包含至少一种能够引发受体个体中的免疫应答的免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列。在一些方面，所述免疫调节剂组合物也可以包含脂质体递送媒介物。A. 核酸在一些方面，本专利技术涉及可用于治疗或预防感染性疾病致病剂的核酸分子。本文所述的核酸分子可以包含在免疫刺激性质粒中，以线性双链或单链DNA、氨基酸序列、核糖核酸(RNA)或其组合的形式。在一些方面，本专利技术涉及含有免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列的核酸分子、载体和宿主细胞(体外、体内或离体)。在一些方面，本专利技术涉及不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或DNA序列。所述质粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。例如，本文所述的pGCMB75.6质粒不包含任何全长或功能性可选择或可筛选的标记基因。pGCMB75.6的序列提供于SEQ ID NO: 1中。在一些方面，本文所述的免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒不包含抗生素抗性基因。例如，所述质粒不包含卡那霉素抗性基因。在一些方面，本文所述的质粒优选不编码免疫原。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因的核酸序列。例如，本文所述的pLacZMB75.6质粒包含LacZ基因作为可筛选的标记物。pLacZMB75.6的图谱提供于图3中，并且pLacZMB75.6的核苷酸序列提供为SEQ ID NO: 4。如图3中所示，pLacZMB75.6类似于pGCMB75.6，但含有LacZ可筛选的标记物。应当理解的是，可以在不显本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫刺激性DNA序列组合物，其包含与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89％序列同源性的核酸分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.28 US 61/9463721.免疫刺激性DNA序列组合物，其包含与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89％序列同源性的核酸分子。2.权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 1的序列具有选自91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。3.权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。4.权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其还包含药学上可接受的载体。5.免疫刺激性DNA序列组合物，其包含与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84％序列同源性的核酸分子。6.权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 4的序列具有至少85％序列同源性。7.权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 4的序列具有至少86％序列同源性。8.权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 4的序列具有选自87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。9.权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 4。10.权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其还包含药学上可接受的载体。11.免疫调节剂组合物，其包含：a. 与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89％序列同源性的核酸序列；和b. 脂质体递送媒介物。12.权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 1的序列具有选自91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。13.权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。14.权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。15.权利要求11的免疫调节剂组合物，其还包含药学上可接受的载体。16.免疫调节剂组合物，其包含：a. 与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84％序列同源性的核酸序列；和b. 脂质体递送媒介物。17.权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 4的序列具有选自85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。18.权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 4。19.权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(...

【专利技术属性】
技术研发人员：A艾克，H韦尔曼，M蒙内斯，R绍尔，A阿伯拉罕，C魏斯，E费尔德休斯，
申请(专利权)人：拜耳动物保健有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE