本发明专利技术公开了一种提高传染性脾肾坏死病毒滴度的添加物及其应用。谷氨酰胺或其衍生物或类似物作为添加物可提高传染性脾肾坏死病毒滴度，应用于传染性脾肾坏死病毒疫苗的制备。在细胞培养基中添加谷氨酰胺，可使传染性脾肾坏死病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可进一步用于传染性脾肾坏死病毒疫苗生产。本发明专利技术通过在传染性脾肾坏死病毒增殖培养基中添加谷氨酰胺，收获的病毒抗原量可提高至少3～3.5倍，同时该疫苗单位时间产能可提高3～3.5倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及一种提高传染性脾肾坏死病毒滴度的添加物及其应用。
技术介绍
鳜（Siniperca chuatsi）是我国重要的淡水特色养殖品种之一，而近年来由传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）引起的鳜虹彩病毒病给鳜养殖产业造成了严重的经济损失。1997年，吴淑勤等人首先在患病鳜中发现了直径150nm的球形病毒，并认为是鳜暴发性传染病的病原。1998年，何建国等人通过回归感染进一步证明了该病毒的病原性，通过组织学研究发现鳜鱼脾脏和肾脏是其感染的主要器官，将其命名为传染性脾肾坏死病毒，并通过主衣壳蛋白（MCP）基因等序列分析确定其为一种虹彩病毒。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次报告，ISKNV是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种，其传染力强，发病率高达30％，致死率高达90％以上，可以感染近60种淡水和海水鱼，给鳜、加洲鲈、乌鳢、美国红鱼、石斑鱼等海淡水鱼类养殖业造成了巨大威胁。自1994年以来，ISKNV给我国鳜养殖业造成的平均年经济损失高达2亿元，是制约鳜养殖业健康发展的主要瓶颈。传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）隶属于虹彩病毒科（Iridoviridae）、肿大细胞病毒属（Megalocytivirus），是该属的代表种。免疫接种是预防传染病发生的主要手段，而抗原的高效获取是疫苗制备的关键。目前传染性脾肾坏死病毒疫苗生产中存在病毒增殖效率不高的问题，影响了疫苗的效果和产业化应用。病毒增殖过程中存在类似肿瘤细胞中的WARBURG效应，葡萄糖通过有氧糖酵解为病毒增殖提供能量和中间产物。某些病毒仅依靠葡萄糖可实现自身的快速增殖；但有些病毒仅依靠葡萄糖酵解不能实现高效增殖，需要寻找合适的添加物来共同促进其病毒的快速增值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高传染性脾肾坏死病毒滴度的添加物及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：谷氨酰胺或其衍生物或类似物作为添加物在提高虹彩病毒滴度中的应用。优选的，虹彩病毒选自肿大细胞病毒属病毒。优选的，虹彩病毒为鳜传染性脾肾坏死病毒。一种用于鳜传染性脾肾坏死病毒增殖的培养基，该培养基中含有谷氨酰胺或其衍生物或类似物。优选的，培养基中含有终浓度为2-10mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似物。优选的，培养基中含有终浓度为4-9mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似物。优选的，培养基中含有终浓度为8mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似物。优选的，谷氨酰胺为L-谷氨酰胺。优选的，以 L-15 培养基为基础培养基，并添加终浓度为4-9mM的L-谷氨酰胺。优选的，以 L-15 培养基为基础培养基，并添加终浓度为8mM的L-谷氨酰胺。优选的，所述培养基还可以加入1%-10%（v/v）的胎牛血清。一种鳜传染性脾肾坏死病毒的增殖方法，是在培养基中添加终浓度为2-10mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似物，进行病毒培养。谷氨酰胺或其衍生物或类似物作为添加物在制备传染性脾肾坏死病毒疫苗中的应用。谷氨酰胺或其衍生物或类似物是指谷氨酰胺或通过化学反应合成的具有谷氨酰胺相似作用的物质，包括但不限于谷胱甘肽、GlutaMAX-I二肽等。本专利技术的有益效果是：本专利技术研究发现ISKNV在缺少谷氨酰胺的培养基中增殖效率非常低，比含有谷氨酰胺培养基的病毒滴度降低了97.85%，是ISKNV增殖复制的关键限制性因子，随后探索了ISKNV培养基中最适谷氨酰胺浓度，确定谷氨酰胺是ISKNV培养基的一种重要添加物，为建立ISKNV疫苗低成本生产工艺奠定基础。本专利技术优选出最适合的鳜传染性脾肾坏死病毒培养基，培养基中添加含有终浓度为2-10mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似物，可以获得高病毒量。研究中发现L-谷氨酰胺对于鳜传染性脾肾坏死病毒是至关重要的，利用L-15+1%v/v-10%v/v的胎牛血清+8mM的L-谷氨酰胺培养ISKNV，可获得最高的病毒产量。本专利技术发现，一般病毒培养基加入L-谷氨酰胺，其常规浓度为2mM，但是2mM的L-谷氨酰胺对于鳜传染性脾肾坏死病毒来说是不够的，不能带来较高的病毒产量。而8mM的L-谷氨酰胺添加下所获得的鳜传染性脾肾坏死病毒的量是2mM的L-谷氨酰胺添加下病毒量的3-3.5倍。附图说明图1为 Gln对ISKNV增殖的影响；图2为ISKNV MCP抗体检测Gln对ISKNV蛋白合成的影响；图3为电镜观察缺乏Gln对病毒粒子成熟的影响；图4为添加不同浓度谷氨酰胺对病毒产量的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中DMEM是缺D-葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠和酚红的培养基。实验例1. 谷氨酰胺是ISKNV 增殖复制的必须因子鳜鱼脑组织细胞系（CPB）第一天传至6孔板中，第二天细胞长到80-90%，用来做病毒感染。感染前用PBS洗细胞2次，以1个MOI接毒（病毒液用DMEM 稀释），在28℃含5%CO2的培养箱中吸附2个小时，移去病毒液，用PBS洗一次，加入完全培养基（DMEM+2%的透析血清+1g/L葡萄糖+2mM的L-谷氨酰胺）或者缺谷氨酰胺的培养基（DMEM+2%的透析血清+1g/L葡萄糖）。细胞感染病毒后，72h分别收集细胞上清，测定上清液中病毒的滴度；收集细胞蛋白用于免疫印迹分析；固定细胞用于间接免疫荧光观察；收集感染细胞固定后用于电镜观察。(1)采用试剂盒CellTiterAQueous One Solution Cell ProliferationAssay测定培养基缺失谷氨酰胺后细胞活力。第一天将细胞传到96孔板中，第二天细胞长到80-90％，加入完全培养基或者缺谷氨酰胺的培养基。细胞72h后，每孔加入20μL CellTiterAQueous One Solution Reagent，在28℃含5％CO2的培养箱中孵育3h，用多功能酶标仪测定吸光度，波长为490nm。（2）病毒滴度的测定根据本实验室付小哲（2014）建立的方法，采用TaqMan探针法的实时荧光定量PCR，用ORF007基因作为特异性引物，根据以下公式换算病毒的TCID50：其中y为病毒拷贝数对数，x为病毒滴度的对数。细胞上清中的病毒DNA提取，使用蛋白酶K直接裂解法。添加蛋白酶K在细胞液的终浓度为160μg/mL，56℃水浴2h，95℃灭活10min，离心，直接取上清作为定量PCR的模板。（3）蛋白印迹（western blot）分析感染的细胞弃去上清，使用RIPA细胞裂解液（主要成分50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂），使用前添加蛋白酶抑制剂（PMSF）裂解细胞，储存于-20℃。取20μl处理后的样品跑SDS-PAGE电泳。电泳结束后将胶条割至合适大小转PVDF本文档来自技高网...
【技术保护点】
谷氨酰胺或其衍生物或类似物作为添加物在提高虹彩病毒滴度中的应用。
【技术特征摘要】
1.谷氨酰胺或其衍生物或类似物作为添加物在提高虹彩病毒滴度中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：虹彩病毒选自肿大细胞病毒属病毒。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：虹彩病毒为鳜传染性脾肾坏死病毒。4.一种用于鳜传染性脾肾坏死病毒增殖的培养基，其特征在于：培养基中含有谷氨酰胺或其衍生物或类似物。5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：培养基中含有终浓度为2-10mM的谷氨酰胺或其衍生物或类似...
【专利技术属性】
技术研发人员：付小哲，李宁求，林蠡，黄志斌，林强，胡先勤，刘礼辉，梁红茹，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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