本发明专利技术公开了一种益生型抗菌肽Enterocin P及其制备方法和应用。本发明专利技术的益生型抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术的抗菌肽Enterocin P基因编码成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能表达抗菌肽的重组质粒；(3)用所述重组质粒转化宿主菌构建基因工程菌；(4)利用所述基因工程菌表达抗菌肽；(5)对抗菌肽的抑菌活性进行检测。本发明专利技术对病原菌具有抑菌活性，可作动物饲料添加剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种益生型抗菌肽Enterocin P及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，抗生素在动物养殖业中的大量滥用，导致抗生素耐药性菌株不断出现，药物残留，环境污染和生态破坏等诸多问题，严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。因此，寻找一种能替代抗生素的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有抗菌效果好，热稳定性好，无毒，无残留，无副作用，安全高效，对环境无污染且不易产生细菌耐药性等优点，有望成为解决抗生素滥用这一难题的有效方法。抗菌肽是生物防御系统中产生的对抗外源性病原体的肽类物质，是生物天然的.防御系统的重要组成部分。抗菌肽来源极其广泛，从植物，昆虫，鸟类，哺乳动物，微生物都已被发现有抗菌肽的产生。迄今为止，已有近千种抗菌肽被相继分离纯化及鉴定。细菌产生的抗菌肽是在其代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽类物质。抗菌肽在益生菌中较为普遍。几乎所有的益生菌都能产生一种或几种抗菌肽物质。近年来，国内外学者已从植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，双歧杆菌，嗜热链球菌，乳酸乳球菌等许多益生菌中分离纯化得到多种抗菌肽物质。抗菌肽Enterocin P是从Enterococcus faecium P13分离纯化获得的抗菌肽，命名为Enterocin P。抗菌肽Enterocin P的结构基因编码71个氨基酸的前肽。其前肽包括27个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的成熟肽。抗菌肽Enterocin P具有较广的抗菌谱，尤其对单核细胞增生李斯特菌.金黄色葡萄球菌等病原菌有明显的抑制效果，具有较好的应用前景。抗菌肽Enterocin P在其产生菌Enterococcus faecium P13中含量极低，从产生菌中提取抗菌肽产量低，费时长，工艺复杂且费用昂贵，无法实现大规模生产，从而制约抗菌肽Enterocin P的实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种具有显著的抗病原菌作用的益生型抗菌肽 Enterocin P及其制备方法和应用。为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术的一种益生型抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本专利技术所述的益生型抗菌肽Enterocin P基因编码成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本专利技术所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pNZ8148-Enterocin P重组质粒；(3)用所述pNZ8148-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌；(4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P；(5)对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。进一步地，在步骤(1)中，人工合成两侧含pstⅠ和HindⅢ的酶切位点的Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。进一步地，在步骤(2)中，将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切酶pstⅠ和HindⅢ双酶切后线性化的pNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin P重组质粒。更进一步地，在步骤(3)中，所述宿主菌为大肠杆菌MC1061；将提取pNZ8148-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000中进行抗菌肽Enterocin P的诱导表达，电转化处理参数为2.0kV、25μF、200Ω、5ms，经氯霉素抗性筛选、PCR验证，酶切鉴定得到正确的含pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌。进一步地，在步骤(4)中，将含pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌接种于含红霉素的GM17液体培养基，30℃培养至OD600nm为0.5时，加入终浓度10ng/ml的nisin诱导表达，培养4h后，4000g离心10min取上清液，将获得的上清液进行0.22μm过滤获得诱导后的无菌上清液，得到益生型抗菌肽Enterocin P。进一步地，在步骤(5)中，采用琼脂扩散法对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测，经37℃培养后，抗菌肽Enterocin P对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌或沙门氏菌的抑菌活性进行检测。本专利技术所述的益生型抗菌肽Enterocin P在动物饲料中的应用。进一步地，所述动物饲料为饲料添加剂。有益效果：本专利技术对病原菌具有较强的抑菌活性，安全，无毒，无副作用，无抗生素耐药性等优点，可用作动物饲料添加剂。本专利技术的所构建的基因工程菌不仅具有乳酸乳球菌本身的益生作用，还具有抗菌肽Enterocin P明显的抗病原菌作用，可以更好的作为益生型饲料添加剂安全有效地应用于动物饲料。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术的抗菌肽来自对动物有益生作用的Enterococcus faecium P13，预期用于动物饲料添加剂中对动物会有更好的作用和益生效果，Enterocin P抗菌肽的成熟肽分子量大约为4.5KDa具有显著的抗病原菌作用。(2)本专利技术所表达的抗菌肽Enterocin P来自于Enterococcus faecium P13，对动物体没有毒性，因此用本专利技术的基因制备的抗菌肽与传统的抗生素药物相比，将是一种更为安全的抗病原菌的短肽类物质。本专利技术的益生型抗菌肽Enterocin P基因为益生菌Enterococcus faecium P13益生型抗菌肽Enterocin P基因Enterocin P，所编码的抗菌肽Enterocin P是从益生菌Enterococcus faecium P13发酵上清液中分离得到的。(3)本专利技术以常用的益生菌乳酸乳球菌为宿主菌构建的基因工程菌，乳酸乳球菌本身就是对动物健康有利的益生菌，同时将抗菌肽Enterocin P在乳酸乳球菌中获得了有效的分泌表达。将Enterocin P基因导入益生菌乳酸乳球菌中获得基因工程菌并进行高效表达，将此基因工程菌作为发酵菌株用于饲料发酵，可用作于动物饲料添加剂，提高饲料的营养价值和动物抗病能力。附图说明图1是本专利技术的按照质粒提取试剂盒提取由含目的基因的大肠杆菌DH5α质粒的示意图，泳道1：目的基因质粒；泳道M：500bp ladder marker；图2是本专利技术的大肠杆菌DH5α目的基因质粒酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：目的基因质粒；泳道M：500bp ladder marker；图3是本专利技术的pNZ8148质粒图谱的示意图；图4是本专利技术的采用TaKaRa Biotech限制性内切酶PstⅠ和HindⅢ操作说明双酶切pNZ8148质粒的示意图，泳道1：pNZ8148质粒；泳道M：1kb ladder marker；图5是本专利技术重组质粒转化大肠杆菌MC1061单菌落的示意图；图6是本专利技术大肠杆菌MC1061单菌落为DNA模板的PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种益生型抗菌肽Enterocin P基因，其特征在于具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种益生型抗菌肽Enterocin P基因，其特征在于具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin P基因编码成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3.权利要求2所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pNZ8148-Enterocin P重组质粒；(3)用所述pNZ8148-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌；(4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P；(5)对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。4.根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，人工合成两侧含pstⅠ和HindⅢ的酶切位点的Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。5.根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切酶pstⅠ和HindⅢ双酶切后线性化的pNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin P重组质粒。6.根据权利要求3所述的益生型抗菌肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈城，
申请(专利权)人：江苏盐城源耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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