通用抗原修复化合物及其使用方法技术

技术编号:13829121 阅读:176 留言:0更新日期:2016-10-13 14:13
用于含醛交联剂固定的组织中抗原修复和氨基酸、肽和蛋白质或其上表位检测改善的抗原修复剂化合物、混合物和制剂以及方法。固定组织与除醛剂溶液接触引起与醛的反应活性,由此修复抗原并改善对氨基酸、肽和蛋白质或表位的检测。还提供试剂盒,其中包含抗原修复剂,可选的用于染色或检测所述蛋白质或抗原或表位的组分,以及试剂盒使用说明。还提供鉴定抗原修复剂的方法。将固定蛋白质与待测试剂接触并一同在溶液中加热。质谱法检得蛋白质峰表示待测试剂是抗原修复剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请交叉引用本申请根据35U.S.C§119(e)要求美国临时申请62/037,905(申请日:2014年8月15日,已放弃)和美国临时申请61/915,271(申请日:2013年12月12日,已放弃)的优先权,本申请通过援引吸纳上述两临时申请的全部内容。联邦资助说明本专利技术得到国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的第1R15AG039008-01号政府资助。政府对本专利技术拥有一定的权利。专利技术背景专利
本专利技术主要涉及组织学,涉及经含醛交联剂(即基于醛的交联剂)保存的组合物或组织中蛋白质的检测。具体地说,本专利技术提供一种抗原修复的方法,其中用除醛剂来修复组合物或组织中因醛类固定剂而化学改性的蛋白质。相关技术说明临床病理实验室用于保存生物材料的常用固定剂有多种,例如戊二醛、甲醛和丙酮及其他有机溶剂。然而,大多数固定过程用到含醛交联剂,如甲醛和戊二醛。固定剂溶液一般为含水甲醛溶液,其中含有钠的磷酸盐,配制成具有缓冲能力且大致等渗的溶液,所述缓冲能力在加入少量强酸或强碱后以尽可能小的波动将pH稳定在pH7.2-7.6。固定溶液将甲醛或戊二醛加到蛋白质的多种基团上,例如胺族基团、酚类基团、硫醇类基团和羟基类基团,由此先形成一系列可逆修饰,包括亚胺、烯胺、羟基亚甲基和两个胺族基团之间的亚甲基交联。随着甲醛固定的继续,会形成蛋白质分子之间或之内可逆的分子间和分子内交联,由此形成致密的网络,这会妨碍石蜡渗透或/和与抗体分子的接触。结果,目标抗原可能被可逆甚至非可逆的掩蔽,或者表位因与含醛固定剂反应而化学改性或破坏。尽管已有多种免疫组化蛋白质法和分析蛋白质法被广泛并高实用性地用于纯化蛋白、蛋白质提取物、细胞或组织样本,仍迫切需要进一步的改进。所述改进可以是关于例如更温和的细胞或组织固定、抗原修复或/和结果再现性的改进、以及标准程序(例如甲醛固定)中受损的相应抗原或表位上抗体应用的改进。因此,本领域公认需要更好方法来消除蛋白质掩蔽和修复抗原。尤其,现有技术缺乏这样的方法和化合物:它们易于经设置或配制用来逆转固定组织中与蛋白质发生的醛反应,具体通过逆转蛋白质中胺族基团(amine groups)上亚胺、烯胺、亚甲基羟基的形成、逆转氨基之间亚甲基交联的形成、以及蛋白质上其他可逆醛改性。本专利技术实现了本领域长期以来的上述需求。专利技术概述本专利技术是关于一种针对用含醛交联剂固定的组织修复抗原并改善氨基酸、肽和蛋白质检测的方法。本专利技术方法包括:第一步,制备除醛剂溶液。然后,使得用含醛交联剂固定的组织与该溶液接触;其中,除醛剂与包含交联剂的醛类之间反应从而修复固定组织中的抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋白质的检测。由于醛和醛加合物以可逆平衡的状态存在于固定组合物或组织,加热和最佳pH条件下,除醛剂能使平衡向释放醛的方向移动,由此去除可逆醛加合物,于是消除蛋白质掩蔽。本专利技术一种相关方法进一步包括加热溶液至约60℃至约125℃,在醛与醛加合物之间达成可逆平衡。本专利技术另一种相关方法还包括通过组织染色来检测去掩蔽的蛋白质或抗原或其所含表位。本专利技术还涉及可用于上述方法的制剂,其为包含化合物或化合物之混合物的溶液。所述化合物可以是除醛剂或除醛剂的混合物。所述制剂包含除醛剂,可选的非离子表面活性剂和稳定剂,它们包含于热溶液中,浓度为与掩蔽蛋白反应的有效浓度。本专利技术还涉及一种试剂盒,其中包含抗原净化剂化合物和/或制剂,可用于本专利技术的抗原修复方法。所述试剂盒还包含染色剂、染料、抗体或能用于检测去掩蔽蛋白质、肽、表位或抗原的其他组分,还包含试剂盒的使用说明。本专利技术还涉及用本文所述制剂来减少组织中加热所致自体荧光的方法。本专利技术还涉及在蛋白质去掩蔽之后增强荧光强度且同时用溶液中本文所述可选的非离子表面活性剂对石蜡包埋样品去石蜡的方法。本专利技术还涉及鉴定抗原修复剂的方法。该方法中,于含水溶液中用含醛交联剂固定蛋白质,将所得溶液冻干,得到固定蛋白质。将固定蛋白质加入含有待定是否为抗原修复剂的化合物的溶液,加热含有所述待定化合物和固定蛋白质的溶液。用质谱法检测该蛋白质,检出该蛋白质则表明待定物质是抗原修复剂。后文将述及目前认为优选的实施方式,仅以公开为目的,从中可看出本专利技术还包含其他内容、特征和优点。附图说明籍此,可以获知并详细了解如上所述本专利技术特征、优点和目的以及其他内容如何展现,对于以上所概括本专利技术更具体的描述可能需要结合附图中展示的具体实施方式。这些附图是本申请说明书的一部分。然而,附图所示为本专利技术的优选实施方式,不构成本专利技术实施方式范围的限制。图1A-1B展示含取代马来酸酐(图1A)和马来酸或(Z)-2-丁烯二酸(图1B)的基本结构。图2A-2D显示胶原IV的抗原修复和免疫检测。对多聚甲醛固定的组织进行抗原修复,采用TBST(图2A),低pH(6.0)柠檬酸钠(图2B),胃蛋白酶预处理(图2C)和0.05%马来酸酐预处理(图2D)。图3A-3C显示免疫组化分析所见固定组织中的抗原修复。用免疫荧光检看多聚甲醛固定组织的冷冻切片(图3A),用免疫荧光检看甲醛固定的石蜡包埋组织(图3B),用免疫组化法和DAB发色团检看甲醛固定的石蜡包埋组织(图3C)。图4A-4E是固定脉管组织中采用马来酸(图4A)、马来酸酐(图4B)、2,3-二甲基马来酸酐(图4C)、富马酸(图4D)和琥珀酸(图4E)的抗原修复比较。图5A-5D显示内皮素-1(图5A)、VEGF(图5B)、冯·威利布兰德因子(von Willebrand)(图5C)、α-平滑肌肌动蛋白和胶原IV两者(图5D)的修复。图6A-6B显示随马来酸浓度升高,经加热固定脑组织匀浆中测得的蛋白质浓度(图6A),与之相比,斑点杂交显示的GAPDH对应升高(图6B)。图7中的显微图像显示多聚甲醛固定的成人脑组织经抗原修复后其中血管的胶原IV染色。图8A-8B中的显微图像显示与仅用0.05%抗坏血酸(图8A)相比,添加非离子表面活性剂Triton X-100令抗原修复后荧光增强(图8B)。图9A-9C中的显微图像显示与不加5%抗坏血酸的非加热组织(图9A)和经加热组织(图9B)相比,加有5%抗坏血酸的经加热组织中自体荧光降低(图9C)。图10A-10C显示多聚甲醛固定的石蜡包埋脑组织脱蜡:加热至70℃,约30分钟,溶液中加2.8mM谷胱甘肽(图10A),5%抗坏血酸(图10B)和2.8mM谷胱甘肽+5%抗坏血酸(图10C)。图11A-11L显示经福尔马林处理的血管紧张肽-I(图11A-11B)抗原修复效果的质谱图,采用的是pH=3.5的水(图11C),pH=5.5的水(图11D),5%咪唑啉酮(图11E),5%柠檬酸(图11F),5%胍(图11G),5%马来酸(图11H),5%的Tris缓冲液,pH=3.5(图11I),5%抗坏血酸(图11J),5%羟胺(图11K)和5%半胱氨酸(图11L)。图12A-12D显示经福尔马林处理的ACTH(图12A)抗原修复效果的质谱图,采用的是5%马来酸(图12B),5%抗坏血酸(图12C)和水(图12D)。ACTH经福尔马林室温下处理48小时。专利技术详述本文中,以下词汇和表述的含义如下所述。充分另作说明,本文中的科技术语的含义即本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于固定组织中抗原修复和改善氨基酸、肽和蛋白质检测的方法,其步骤包括:制备含有除醛剂的溶液;以及令用含醛交联剂固定的组织与所述溶液接触;其中,所述除醛剂与所述包含交联剂的醛之间的反应修复固定组织中的所述抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋白质的检测。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.12 US 61/915,271;2014.08.15 US 62/037,9051.一种用于固定组织中抗原修复和改善氨基酸、肽和蛋白质检测的方法,其步骤包括:制备含有除醛剂的溶液;以及令用含醛交联剂固定的组织与所述溶液接触;其中,所述除醛剂与所述包含交联剂的醛之间的反应修复固定组织中的所述抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋白质的检测。2.如权利要求1所述的方法,其中,所述含醛交联剂是甲醛或戊二醛。3.如权利要求1所述的方法,其中,所述除醛剂在所述溶液中的浓度是约0.05%至约30%。4.如权利要求3所述的方法,其中,所述溶液的pH处于针对所述除醛剂的特定范围。5.如权利要求1所述的方法,还包括:将所述溶液加热至约60℃至约125℃从而在醛与醛加合物之间达成可逆平衡。6.如权利要求5所述的方法,其中,所述溶液降低加热后组织中的自体荧光。7.如权利要求1所述的方法,还包括对组织进行染色来检测所述蛋白质、肽、抗原或所述蛋白质、肽、抗原包含的表位。8.如权利要求1所述的方法,其中,所述除醛剂是氨基乙醇,N-甲基氨基乙醇,2-(羟甲基)哌啶,2-(羟甲基)吡咯烷,N-苄基氨基乙醇,亚氨基(二乙醇),2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇;丝氨酸,苏氨酸,壳聚糖,三(羟甲基)氨基甲烷,精氨酸,赖氨酸,甘氨酸,组氨酸,5-羟色氨酸,肌肽,胍,吗啉,2-(羟甲基)哌啶,氨,碳酸铵,羟胺,O-烷基化羟胺,N-烷基化羟胺,O,N-烷基化羟胺,羟甲基胺,甲氧基胺,二丁胺,三亚乙基四胺,苄胺,噻苯咪唑,苯并三唑,三唑,二氢吲哚,苯并胍胺,3,4-二氨基苯甲酸,4-氨基苯甲酸甲酯,苯胺;1-氨基-2-吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺,邻氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸甲酯,邻氨基苯甲酰胺;邻苯二胺;4-氨基苯甲酸;3,4-二氨基苯甲酸;肼,N-甲基肼,N-苯肼,甲基酰肼,2,4-二硝基苯基酰肼,脲,尿囊素,咪唑啉酮,苯巴比妥,甘脲,双缩脲,半胱胺,半胱氨酸,谷胱甘肽,亚硫酸氢钠,对巯基苯甲酰胺,丙二酰胺,草酰胺,乙酰乙酰胺,草酰胺,焦谷氨酸,琥珀酰胺,乙二胺-N,N’-二乙酰乙酰胺,N-(2-乙基己基)乙酰乙酰胺,N-(3-苯丙基)乙酰乙酰胺,聚酰胺;聚酰胺酯,山梨糖醇,己二醇,葡萄糖,纤维素,羟基香茅醇,双甲酮,抗坏血酸,戊二酮,2-丁酮,环己酮,2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮,2-戊酮,5,5-二甲基-1,3-环己二酮,脱氢乙酸,1,3-二羟基丙酮二聚体,没食子酸甲酯,没食子酸乙酯,没食子酸丙酯,焦棓酚,水杨酰胺;水杨酰苯胺;4,5-二羟基-2,7-萘二磺酸,柠康酸,马来酸酐,2,3-二甲基马来酸酐,1(E)-2-丁烯二酸二甲酯,2-硫烷基丁-2-烯二酸,丁-2-烯二酸,(E)-3-硝基丙-2-烯酸酯或盐,(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸,(Z)-2-甲氧基丁-2-烯二酸,(Z)-2-过氧羟基丁-2-烯二酸,2-甲氧基丁-2-烯二酸,(Z)-2-氟丁-2-烯二酸酯,4-氧代戊-2-烯酸,(E)-2,3-二氯丁-2-烯二酸,二氯马来酸,(Z)-2-碘代丁-2-烯二酸,(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸,(Z)-2-羟基-3-甲基丁-2-烯二酸,2,3-二氘化丁-2-烯二酸,(E)-3-硝基丁-2-烯酸,丁-2-烯二酸酯或盐,(E)-4-氯-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,(E)-2,3-二氟丁-2-烯二酸酯或盐,(E)-4-羟基-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,氢富马酸酯或盐,(Z)-2-烷基硫丁-2-烯二酸,2,3-二氟富马酸,(E)-4-羟基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,一氟富马酸酯或盐,氟代富马酸,(Z)-2-氯丁-2-烯二酸,2-过氧羟基丁-2-烯二酸,过氧马来酸,2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸,2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸,2-丁烯二酸,[(E)-3-羧基-1-羟基亚丙-2-烯基]氧鎓,(E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或盐,2-甲基富马酸酯/盐,柠康酸,2,3-二氯马来酸,3,4-二氯-5-羟基呋喃-2(5H)-酮,3-氯羰基丙烯酸乙酯,(E)-4-氧代戊-2-烯酸乙酯,[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鎓,(Z)-丁-2-烯二酸,马来酸二甲酯,富马酸二甲酯;活性碳,氧化铝;二氧化硅;胺官能化的二氧化硅;滑石;沸石;或多官能有机物,其中既具有伯胺或仲胺基团又具有羧酸、酚、酰胺、羟基、脲、酯或巯基基团,至少其中之一会与醛反应;环糊精;或上述化合物的各种组合。9.如权利要求1所述的方法,其中,所述溶液还包含约0.1%至约5%的非离子表面活性剂,所述非离子表面活性剂去除石蜡包埋样品中的石蜡并增强抗原修复后的荧光强度。10.如权利要求9所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂是聚西托醇1000,鲸蜡硬脂醇,鲸蜡醇,椰油酰胺二乙醇胺,椰油酰胺单乙醇胺,癸基葡糖苷,IGEPAL CA-630,异鲸蜡醇聚醚-20,月桂基葡糖苷,NP-40,Nonidet P-40,壬苯醇醚-9,壬苯醇醚,月桂酸单甘油酯,八乙二醇单十二烷基醚,油醇,泊洛沙姆,泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯,聚山梨酸酯,脱水山梨醇单硬脂酸酯,脱水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;吐温80;辛基-、癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麦芽糖苷或脱氧胆酸。11.如权利要求1所述的方法,其中,所述溶液还含有稳定剂,所述稳定剂选自防腐剂,抗真菌剂,抗细菌剂,染料,颜料,阴离子洗涤剂,金属盐,抗氧化剂或其组合。12.如权利要求11所述的方法,其中,所述抗氧化剂是浓度约2mM至约400mM的谷胱甘肽。13.一种制剂,其于溶液中包含选自以下所述的化合物:氨基乙醇,N-甲基氨基乙醇,2-(羟甲基)哌啶,2-(羟甲基)吡咯烷,N-苄基氨基乙醇,亚氨基(二乙醇),2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇;丝氨酸,苏氨酸,壳聚糖,三(羟甲基)氨基甲烷,精氨酸,赖氨酸,甘氨酸,组氨酸,5-羟色氨酸,肌肽,胍,吗啉,2-(羟甲基)哌啶,氨,碳酸铵,羟胺,O-烷基化羟胺,N-烷基化羟胺,O,N-烷基化羟胺,羟甲基胺,甲氧基胺,二丁胺,三亚乙基四胺,苄胺,噻苯咪唑,苯并三唑,三唑,二氢吲哚,苯并胍胺,3,4-二氨基苯甲酸,4-氨基苯甲酸甲酯,苯胺;1-氨基-2-吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺,邻氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸甲酯,邻氨基苯甲酰胺;邻苯二胺;4-氨基苯甲酸;3,4-二氨基苯甲酸;肼,N-甲基肼,N-苯肼,甲基酰肼,2,4-二硝基苯基酰肼,脲,尿囊素,咪唑啉酮,苯巴比妥,甘脲,双缩脲,半胱胺,半胱氨酸,谷胱甘肽,亚硫酸氢钠,对巯基苯甲酰胺,丙二酰胺,草酰胺,乙酰乙酰胺,草酰胺,焦谷氨酸,琥珀酰胺,乙二胺-N,N’-二乙酰乙酰胺,N-(2-乙基己基)乙酰乙酰胺,N-(3-苯丙基)乙酰乙酰胺,聚酰胺;聚酰胺酯,山梨糖醇,己二醇,葡萄糖,纤维素,羟基香茅醇,双甲酮,抗坏血酸,戊二酮,2-丁酮,环己酮,2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮,2-戊酮,5,5-二甲基-1,3-环己二酮,脱氢乙酸,1,3-二羟基丙酮二聚体,没食子酸甲酯,没食子酸乙酯,没食子酸丙酯,焦棓酚,水杨酰胺;水杨酰苯胺;4,5-二羟基-2,7-萘二磺酸,柠康酸,马来酸酐,2,3-二甲基马来酸酐,1(E)-2-丁烯二酸二甲酯,2-硫烷基丁-2-烯二酸,丁-2-烯二酸,(E)-3-硝基丙-2-烯酸酯或盐,(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸,(Z)-2-甲氧基丁-2-烯二酸,(Z)-2-过氧羟基丁-2-烯二酸,2-甲氧...

【专利技术属性】
技术研发人员:J·埃里克森C·福勒特S·巴克W·莫里
申请(专利权)人:休斯敦大学系统
类型:发明
国别省市:美国;US

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