一种制备骨诱导成骨制剂的方法技术

本发明专利技术提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对外源骨基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白；3.让外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合，让外源蛋白与估计值形诱导成骨制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种修复骨损伤的制剂，特别的，尤其涉及一种一种诱导骨生成，促进骨组织形成或者修复骨损伤的制剂以及方法。
技术介绍
骨诱导成骨技术是目前外科整复和牙周重建常用的一种技术，主要利用骨诱导因子激活骨增长和生产功能产生新骨。骨诱导因子较多，现研究主要集中于骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein。BMP)家族蛋白研究，骨形态发生蛋白属低分子糖蛋白类，现已发现了骨形态发生蛋白l-14多种蛋白成分，其中骨形态发生蛋白2的骨诱导活性最强，其它骨形态发生蛋白成分对骨形态发生蛋白2有协同作用，共同参与诱导成骨过程。有学者认为骨形态发生蛋白是转化生长因子13(TGF一13)超家族的一种，它具有明显的骨再生和骨整合能力，能够诱导软骨和骨形成，并且能够诱导血管周围的间充质细胞转化为骨干细胞，它与细胞外基质大分子相互作用形成的骨形态发生蛋白是调节骨形成作用的基础。骨形态发生蛋白广泛存在于哺乳动物的骨基质和牙基质中，是一种无种属特异性的，属局部生长因子的酸性糖蛋白，但骨中骨形态发生蛋白随年龄的增大而逐渐减少，而牙基质中的骨形态发生蛋白未见减少。还有研究显示脱钙牙基质(demineralized dental matrix，DDM)中骨形态发生蛋白的粗提物是同质量脱钙骨基质(demineralized bone matrix，DBM)中的10倍，相应地脱钙牙基质在肌肉中诱导成骨量应为同质量脱钙骨基质的10倍。但是，单纯的骨形态发生蛋白在体内扩散太快，也易被蛋白酶分解，因而不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥；骨形态发生蛋白的纯化制取比较困难，成本较高，难以在临床广泛推广使用；有研究发现纯化高的骨形态发生蛋白并不能取得较高的生物诱导活性，只有与相应骨基质联合使用，才能有效诱导成骨，这是因为胶原和基质可能影响了羟基磷灰石晶体中的钙和磷酸盐根离子，有机物也可能扮演了一个结晶化的中心。关于骨形态发生蛋白的载体研究虽有许多报道，如采用羟基磷灰石、磷酸盐三钙、聚酯、胶原、脱矿骨基质、氧化钛、血块等载体，但是骨形态发生蛋白与载体间的结合方式、复合方法、复合比例，仍未有统一的结论。因此，当前研究的方向转为复合性骨诱导材料的研制。研究认为脱钙牙基质(demineralized dentin matrix，DDM)是一种富含骨形态发生蛋白、胶原及其它蛋白多糖的复合物，是一种新型的具有骨诱导作用的人类同源性的生物活性
材料，它富含多种骨诱导蛋白及其载体的复合物，形成了一种骨形态发生蛋白的天然缓慢释放系统。例如中国专利技术专利95112416.1；或者中国专利技术专利申请，申请号201310602830.7；申请号201310602878.8中介绍了通过处理牙齿获得这些可以促进骨头伤口愈合或者再生的材料。另外，也在牙基质中添加一些成分，进而改进牙基质的效果，例如中国专利技术专利申请，申请号201510089391.3和申请号201110129457.9中的描述。当然，还有采用体外表达BMP蛋白然后和骨骼粉末或者其他粉末混合，这种方法制备的修复材料，实际效果并不理想，主要是BMP蛋白在体外容易失去活性，和这些粉末混合后，被施加到损伤的骨骼中，容易被酶降解也失去活性。因此只有在体内保持BMP的活性，才能更好的达到促进骨组织的生长。以上描述的方法，虽然对骨头损伤的修复具有一定的效果，但是仍然存在很多固有的缺陷，主要体现在以下几点：(1)牙齿作为活性BMP的来源有限，不能满足日益增长的市场需要，毕竟光靠牙基质作为原料，限制了行业的发展；(2)对牙齿、骨骼进行粉碎处理后，通常在酸性溶液进行脱钙，获得含有活性蛋白BMP的粉末，但酸碱等处理虽然可以释放钙离子，暴露BMP蛋白，同时也对BMP的蛋白具有极大的损伤，因为BMP容易在酸性条件下变性而失去活性；这样就降低了BMP蛋白的利用效率。因此，有必要对现行方法进行改进，或者采用新的方法获得骨修复材料。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对牙基质进行脱钙处理；2.然后再向经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP，即骨形态发生蛋白，从而形成诱导成骨制剂。另一方面，本专利技术提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对2份牙基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的2份牙基质进行去除骨形态发生蛋白处理；3.最后让提取的骨形态发生蛋白与其中的1份脱钙处理的牙基质进行混合，从而形成诱导成骨制剂。另一方面，本专利技术提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对外源骨基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白处理；3.让外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合，让外源蛋白与骨基质形成诱导成骨制剂。在一些优选的实施方式中，对一种脱钙人牙齿进行脱钙处理的方法包括如下步骤：
(1)、用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉；(2)、将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65-0.72当量盐酸液浸泡，在36摄氏度下浸泡12小时完成脱钙；(3)、脱钙后产品低温干燥获得冻干粉末。优选的，冻干粉末在摄氏35度3％的双氧水中浸泡30分钟即得到脱钙人牙基质。优选的，所述的人牙基质冻干粉末或者颗粒，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。优选的，脱钙后产品为人牙基质颗粒置于酒精液中贮存备用。其中，酒精的浓度为任意浓度下的酒精溶液，例如70％，60％，50％，75％，78％，80％，85％或者95％。在优选的方式中，先将牙用50％的消毒液(例如含有有效成分1.2％的次氯酸钠)浸泡消毒原料牙，浸泡消毒时间为45分钟、温度为摄氏36度；用机械方法去除牙体上无使用价值的部分；用1.2次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织，浸泡消毒时间为45分钟、温度为摄氏36度。然后在进行牙齿的粉碎处理。这里的牙可以是人的牙齿，也可是任何哺乳动物的牙齿。优选的为人牙。在一些优选的方式中，对已经经过脱钙处理的牙齿基质添加外源BMP蛋白，添加外源蛋白的方法如下：首先让脱钙的牙基质粉末悬浮在PH＝6.0-7.5的磷酸盐缓冲液中(100克配置1升缓冲液)，然后把外源BMP用相同PH＝6.0-7.5的磷酸盐缓冲液溶解(浓度为1.0M每升)，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为12-120转/分钟，同时在室温下进行搅拌12-24小时，在搅拌的时候，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的20％－35％(0.2-0.35M/L)以下停止搅拌，然后离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到人牙基质，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。在一些优选的方式中，对2份人牙基质进行脱钙处理，然后对脱钙处理的基质进行蛋白的提取，然后让提取的BMP蛋白与其中的一份人牙基质进行混合处理。处理方法为：首先让经过脱钙，脱蛋白(BMP活性蛋白和或者其他杂蛋白)提取的牙基质粉末悬浮在PH＝7.0的磷酸盐缓冲液中(120克配置1升缓冲液)，然后把外源BMP(从2份基质中提取的BMP蛋白)用磷酸盐缓冲液(PH＝7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对外源骨基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白；3.让外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合，让外源蛋白与估计值形诱导成骨制剂。

【技术特征摘要】
1.一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对外源骨基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白；3.让外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合，让外源蛋白与估计值形诱导成骨制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的骨骼为人骨骼，对人骨进行脱钙处理的步骤如下：(1)、将收集的人骨入清水容器内，在摄氏5度以下条件储存；(2)、用1.2％d次氯酸钠浸泡消毒原料骨骼，时间为30-55分钟、温度为摄氏35-40摄氏度；(3)、去除骨骼上无使用价值的部分；(4)、用机械方法将骨骼组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉，平均粒径为0.10-0.25毫米；(5)、再用1.2％的次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的骨骼组织，浸泡消毒时间为10-45分钟、温度为摄氏35-40度；(6)、将骨骼组织颗粒剂或者冻干粉置入到0.65-0.72当量盐酸液浸泡，在38摄氏度下浸泡16-20小时完成脱钙；(7)、低温干燥，获得脱钙的骨基质粉末或者颗粒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对步骤已经脱钙骨骼处理后的骨骼基质进行提取蛋白的处理的方法如下：a、首先把处理的脱钙骨骼质除去双氧水，用灭菌水冲洗多次直至无双氧水存在；获得骨骼基质粉末；然后让脱钙的骨骼粉末1000克悬浮在2升PH＝7.2的磷酸盐缓冲液中；b、让酶解锅内温度调至48-50℃，pH值调至8.5时加入胰酶O.35g；酶的反应时间均...

【专利技术属性】
技术研发人员：边俊杰，毕晓寰，
申请(专利权)人：深圳市光明创博生物制品发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44