本发明专利技术属于多糖领域。本发明专利技术涉及分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖及其制备方法和其应用。本发明专利技术以水或水醇溶液为介质，用碱性溶液提取茯苓粉中的茯苓多糖成为茯苓多糖碱提取液。氯乙酸与适当过量的碱性溶液中和后，与茯苓多糖碱提取液混匀，在30℃至90℃逐步升温的条件下合成分子量分布广泛(0.6×104至2.0×106道尔顿)的羧甲基取代度大于1.000的羧甲基茯苓多糖。用超滤法分离纯化分子量0.6×104至1.0×106道尔顿的组分，优选应用作为口服制剂的原料；分离纯化分子量1.0×106以上至2.0×106道尔顿的组分，优选应用作为注射制剂的原料。本发明专利技术的制备方法为液相不振荡工艺，无需振荡设备，且具有简便、省料、节能、环保等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多糖领域，尤其涉及作为新型抗肿瘤生物反应调节剂(BRM)的分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,CMP)及其制备方法和其应用。
技术介绍
茯苓为多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，自古为传统中药“四君八珍”之一，具有“利水渗湿、健脾宁心”的功效，所含成分茯苓多糖具有β(1→3)结合的葡萄糖苷线性结构和β(1→6)结合的葡萄糖苷支链的结构。试验表明，未经化学改性的茯苓多糖没有抗肿瘤活性，茯苓在沸水中的煎煮得率不超过2％。经过化学改性后生成的羧甲基茯苓多糖具有水溶性，利于人体的吸收，而且羧甲基茯苓多糖能诱生与促诱生人血淋巴细胞产生干扰素-α(IFN-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞活性因子，具有增强免疫、抗肿瘤(主要通过增强免疫功能和激活免疫监视系统来发挥抗肿瘤活性)、抗病毒、抗放射、保肝、改善睡眠、降血糖、抗衰老等药理学活性，可广泛用于肿瘤手术后的免疫治疗，也可用于肿瘤放化疗的辅助治疗，显著增强恶性肿瘤患者的免疫功能，减少和消除放化疗的副反应，增强肿瘤患者的免疫功能，促进肿瘤患者食欲，改善肿瘤患者睡眠，提高肿瘤患者的生存质量与延长生命。已有试验证明：羧甲基茯苓多糖按13.2g/kg剂量给小鼠灌胃，无急性毒性反应；羧甲基茯苓多糖按0.22-1.73g/kg剂量(所用剂量为人临床剂量的180倍)给大鼠灌胃12周，无毒副反应，连续用药3个月安全；毒理试验也证明，羧甲基茯苓多糖无致突变、致畸胎的结果。Hamuro等人(1971年)采用异丙醇与水为介质，在液固相振荡条件下合成制取羧甲基茯苓多糖，因需大型振荡设备，难以实现工业化生产，且需要大量的有机溶剂(如乙醚、甲醇、丙酮、醋酸和乙醇)对羧甲基茯苓多糖进行后处理及纯化，不仅生产成本较高，还造成环境污染。石清东等人(1996年)以乙醇与水为介南，采用在液固相搅拌条件下合成制取羧甲基茯苓多糖，所制取的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D·S)为0.92，表现为产品的溶解度较小，杂质质量较高，以NaC1计，含氯化物％＜3.0％；以Pb计，重金属％＜0.002％，且较难分离除去所含杂质，大大限制了所研制的羧甲基茯苓多糖的制剂应用和临床应用范围，如该法制
取的羧甲基茯苓多糖不能用于制备注射剂。因此，制备分子量分布广泛的羧甲基取代度(D·S)大于1.000的羧甲基茯苓多糖，以提高其溶解度和拓宽其制剂应用和临床应用范围，成为人们迫切需要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖的制备方法，包括如下步骤：1)茯苓粉加入到水或水醇混合液中，搅拌均匀后，加入2.0-8.0mol/L的碱性溶液，搅拌至完全溶解，得茯苓多糖碱化液；2)1.0-10mol/L氯乙酸与适当过量的2.0-10mol/L碱性溶液，充分反应后，加入到1)步所得的茯苓多糖碱化液中，在30℃至90℃逐步升温的条件下合成反应，分离纯化生成的羧甲基茯苓多糖，即得。上面近述羧甲基茯苓多糖的分子式为(C6H10O5)n,可由本领域熟知的方法推断得，用碱化提取法制得的茯苓多糖碱化提取液，相当于1)步制得的茯苓多糖碱化液；或碱提取酸沉淀法制得的茯苓多糖粗品，再进一步碱化。上面所述碱化提取法是指：茯苓粉加入浓度为2.0-8.0mol/L或3.0-8.0mol/L的碱性溶液搅拌提取，压滤分离，取滤液，即得茯苓多糖碱化提取液。上面所述碱提取酸沉淀法是指：茯苓粉加入浓度为2.0-3.0mol/L或3.0-4.0mol/L的碱性溶液搅拌提取，压滤分离，取滤液；滤液加酸(如醋酸、盐酸、硫酸或硝酸)，得酸沉淀物；沉淀物经离心、水洗，即得茯苓多糖粗品。上面所述水醇溶液为本领域熟知的醇溶剂加水制得的溶液，所述醇溶剂选自甲醇、乙醇、丙二醇的任一种或其组合。本专利技术所述碱性溶液由本领域熟知的碱性物质加水溶解制得，所述碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾的任一种或其组合，优选氢氧化钠或氢氧化钾。进一步，氯乙酸溶液的浓度为2.0-9.0mol/L，优选为3.0-8.0mol/L，更优选为5.0-7.0mol/L，最优选为5.5-6.5mol/L。进一步，所述适当过量是指碱性溶液中碱性物质的实际用量比其与氯乙酸发生中和反应所需理论用量过量2.0-20％，优选过量5-15％，更优选过量6-12％，最优选过量8-10％。进一步，2)步反应液在30℃至90℃条件下进行取代反应3h至12h，优选反应温度为35℃至85℃，更优选为40℃至82℃，最优选为55℃至80℃；优选反应时间为3h至12h，更优选为6h至10h。进一步，所述分离是指在2)步反应生成液中加入1.0-5.0mol/L的酸性溶液，调其pH值5.0-7.0后，加入3-5倍体积的醇溶剂，析出羧甲基茯苓多糖粗品；所述醇溶剂选自甲醇、乙醇、丙二醇的任一种或其组合。本专利技术所述酸性溶液由本领域熟知的酸性物质加水溶解制得，优选所述酸性物质选自醋酸、盐酸、硫酸或硝酸的任一种或其组合，优选为盐酸或硝酸，最优选为盐酸。本专利技术合成反应的原理为：(C6H10O5)n+nC1CH2COOH+nNaOH→(C8H12O7)n+nNaC1+nH20，(C6H10O5)n+nC1CH2COOH+nKOH→(C8H12O7)n+nKC1+nH2O。由于合成反应中氯乙酸与碱性溶液的浓度较高，存在氯乙酸与碱性物质的其他副反应，生成一定量的氯化钠、氯乙酸钠、羟乙酸钠、氯化钾、氯乙酸钾、羟乙酸钾等小分子杂质。进一步，所述纯化是指羧甲基茯苓多糖粗品加水配成1.0-6.0％或2.0-5.0％或3.0-4.0％的水溶液，加入1.0-5.0mol/L的碱性溶液调pH值9.0-12.0，搅拌至羧甲基茯苓多糖粗品完全溶解；加入30％H2O2溶液，其用量为溶解液总容积的0.1‰-1.0‰，进行脱色反应；加入1.0-5.0mol/L的酸性溶液调pH值5.0-7.0，超滤去除分子量小于0.6×104道尔顿的羧甲基茯苓多糖及其他小分子杂质。进一步，碱性溶液的浓度为1.0-4.0mol/L，优选为1.5-3.5mol/L，更优选为2.0-3.0mol/L，最优选为2.5mol/L。进一步，脱色反应的温度为10℃-70℃，优选为15℃-60℃，更优选为20℃-50℃。脱色反应的时间根据脱色反应的完成程度而定，通常为2h至48h，优选为5h至40h，更优选为10h至30h，最优选为15h至20h。进一步，酸性溶液的浓度为1.0-9.0mol/L，优选为2.0—8.0mol/L，更优选为3.0-7.0mol/L，最优选为4.0-6.0mol/L。进一步，所述超滤是用DH-UF中空纤维超滤器进行超滤。根据实际需要，可对反应生成的分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖进行分级分离纯化，以提高其纯度。进一步，所述分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D·S)大于1.000。进一步，分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖分子量分布为0.6×104至2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)茯苓粉加入到水或水醇混合液中，搅拌均匀后，加入2.0‑8.0mol/L的碱性溶液，搅拌至完全溶解，得茯苓多糖碱化液；2)2.0‑10mol/L氯乙酸与适当过量的2.0‑10mol/L碱性溶液充分反应后，加入到1)步所得的茯苓多糖碱化液中，在30℃至90℃逐步升温的条件下进行合成反应，分离纯化生成的羧甲基茯苓多糖，即得，其羧甲基取代度大于1.000；所述适当过量是指碱性溶液中碱性物质的实际用量比其与氯乙酸中和所需理论用量过量2.0‑20％。
【技术特征摘要】
1.一种分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)茯苓粉加入到水或水醇混合液中，搅拌均匀后，加入2.0-8.0mol/L的碱性溶液，搅拌至完全溶解，得茯苓多糖碱化液；2)2.0-10mol/L氯乙酸与适当过量的2.0-10mol/L碱性溶液充分反应后，加入到1)步所得的茯苓多糖碱化液中，在30℃至90℃逐步升温的条件下进行合成反应，分离纯化生成的羧甲基茯苓多糖，即得，其羧甲基取代度大于1.000；所述适当过量是指碱性溶液中碱性物质的实际用量比其与氯乙酸中和所需理论用量过量2.0-20％。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖，其分子量分布范围为0.6×104至2.0×106道尔顿。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖分离纯化得到分子量分布0.6×104至1.0×106道尔顿的组分。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述分子量分布广泛的羧甲基茯苓多糖分离纯化得到分子量分布1.0×106以上至2.0×106...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈春霞，
申请(专利权)人：陈勇，陈一雄，陈春霞，
类型：发明
国别省市：福建;35
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