本发明专利技术公开了一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)‑3‑(二甲胺基)‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙醇的方法，与现有技术相比，在制备(S)‑3‑(二甲胺基)‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙醇的过程中采用了本发明专利技术的工程化酮还原酶多肽，使得整个反应过程酶量用量低、反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法。
技术介绍
度洛西汀(Duloxetine)是一种低副作用的，能够有效治疗精神紊乱和代谢紊乱的药物(US patent 5,023,269)。合成度洛西汀的关键是获得含有手性中心的中间体(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇(DMAA)。不对称还原3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮(DMAK)得到该中间体是目前最有效、研究最多的方法，其反应过程如下所示：化学方法还原的经济性、安全性和环境友好性较低。生物酶法还原得如美国专利US patent 2010/0151534等报道，公开了一种利用酮还原酶(KRED)生产(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，该方法酶量较高(0.6％)，反应时间长(30h)，底物浓度低(15％)。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种能够将底物3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮还原成产物(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的工程化酮还原酶多肽，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90％的同源性。其中，序列2为来自Candida magnoliae
的野生型酮还原酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获得，突变体获得增强的活性和稳定性，可以通过高通量筛选(HTS)等方法探知，上述的改变氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领域内的常规技术。本专利技术提供了一种编码多肽的多核苷酸。优选地，所述的多核苷酸选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。本专利技术还提供了一种表达载体，包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的所述的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列为SEQ ID NO：43。该表达载体为pET30a。本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术的另一个目的是提供一种使用上述酮还原酶多肽生物催化制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，所述方法以3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮为底物，在适于将其不对称还原为(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的反应条件下与上述酮还原酶多肽接触。优选地，所述反应是在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在pH为6.0～8.0、温度为25℃～35℃的缓冲溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法。优选地，所述葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：在制备(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的过程中，采用了本专利技术的工程化酮还原酶多肽，与现有技术相比，其酶量用量低(0.3％)，反应时间短(12h)，底物浓度高(20％)，更加适合产业化应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。实施例1(酮还原酶的制备)采用常规方法制备获得了酮还原酶催化剂：序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成，与pET30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37℃培养至OD600至0.8，加入诱导剂IPTG，继续培养16小时，离心收集沉淀，加入磷酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破碎10分钟，离心取上清，冷冻得到酮还原酶酶粉。实施例2(酮还原酶的筛选)由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在大肠杆菌中表达获得的酮还原酶2mg，GDH(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)2mg，NADP 1mg，底物DMAK 50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05M三乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30℃1000rpm搅拌，1h后取样HPLC检测，序列43的转化率和ee均为>99％，因此采用序列43作为进一步研究对象。实施例3(酶催化反应)向50mL反应三口瓶中依次加入2.0g底物DMAK，3g葡萄糖，9mL 0.05M pH 7.0三乙醇胺缓冲液，温度调节至30℃，900r/min搅拌，以浓度为15％的Na2CO3溶液维持反应体系pH至7.0，向反应瓶中加入含有6mg酮还原酶(由序列43在大肠杆菌中表达获得)，6mg葡萄糖脱氢酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)和0.5mg NADP的三乙醇胺缓冲液，反应12h，HPLC检测转化率99％，加热浓缩至体积10mL，过滤取滤液，采用浓度为25％的NaOH溶液调节pH至12.0-12.5之间，冰水浴降温至0℃，保温12h，过滤得到产品1.7g，含量95％。上述实施例只为说明本专利技术的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本专利技术的内容并据以实施，并不能以此限制本专利技术的保护范围。凡根据本专利技术精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够将底物3‑（二甲胺基）‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙酮还原成产物(S)‑3‑(二甲胺基)‑1‑(噻吩‑2‑基)‑1‑丙醇的工程化酮还原酶多肽，其特征在于，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。
【技术特征摘要】
1.一种能够将底物3-（二甲胺基）-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮还原成产物(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的工程化酮还原酶多肽，其特征在于，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。2.编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。4.一种表达载体，包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的权利要求3所述的多核苷酸。5.根据权利要求4所述的表达载体，其为pET30a。6.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。7.根据权利要求6所述的宿...
【专利技术属性】
技术研发人员：付敏杰，张涛，
申请(专利权)人：苏州汉酶生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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