用于重组表达感兴趣产物的新型真核细胞和方法技术

本公开涉及适合重组生产感兴趣产物的新型真核细胞，其中内源基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损，从而在重组表达感兴趣多肽时增加其生产率。此外，本公开提供相关技术，其中这类宿主细胞被用于重组生产技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及重组表达
提供了能提高感兴趣产物生产的经改变真核细胞以及其在重组表达方法中的应用等。此外，提供能在选择过程早期基于真核细胞表达谱鉴定以提高的稳定性和高产率表达重组产物的真核细胞。所述真核细胞优选是哺乳动物细胞。
技术介绍
随着生物制药对当今医学越来越重要，生物制药市场持续高速增长。目前，越来越多的生物药品在真核细胞如特定的哺乳动物细胞中生产。因此，在真核细胞中成功且高产率生产生物药品是关键的。产生这类生产感兴趣治疗蛋白的细胞系的时间是任何生物药品进入临床所需时间的重要部分。此外，也鉴于生物药品的生产成本，拥有高且稳定表达的重组真核细胞系很重要，特别是哺乳动物细胞系。为了生物制药尤其是在工业规模上的生产效率，对克隆选择工艺付出巨大努力，目标是在短时间内鉴定有良好表达稳定性和生长特性的高产克隆。为生产治疗蛋白而产生重组细胞克隆通常包括重度筛选个体克隆以检测和分离高表达克隆。然而，即使在筛选过程中鉴定出高表达克隆，这些初始高表达克隆通常随着时间推移而失去其有利表达特性且表达产率减小。延长的继代培养期间细胞克隆中重组蛋白表达的逐步损失是许多细胞系如CHO细胞系的共同问题，称为不稳定性。此不稳定性严重影响重组生产多肽的工业生产过程。因此，必须审慎其事，才能从成功表达的细胞群体中，甚至从初时以良好产率表达感兴趣蛋白的细胞克隆中鉴定出如下细胞/个别细胞克隆：它们在长期培养中兼具高度生产稳定性，因而不易表现出重组蛋白表达逐渐损失。这些克隆也称为“稳定”克隆。在长时间培养期中，稳定克隆应在8-12周时间内损失不超过初始生产率的30％、优选不超过25％。生产率定义为容积生产率，其是在某一培养时间点每体积蛋白的表达量(如g/L)，个别地，作为细胞比生产率，是每天每细胞表达蛋白的具体量(如pg/细胞/天)。为防止有倾向于不稳定并因而在长时间培养中会损失效价的细胞克隆被选择用于后续大规模生产，通常在数周到多至数月中进行广泛的稳定性分析以去除在该时间段中变得不稳定的那些细胞克隆并鉴定稳定克隆。因此，大规模生产的治疗蛋白和其它重组多肽所用重组细胞克隆的产生通常包括过量且耗时地筛选个体克隆以鉴定也能显示大规模生产所需表达稳定性的高表达细胞克隆。此实践延长生物技术如生物药品生产过程的开发。甚至当使用在所用选择条件下有利于高表达细胞存活的高严谨选择系统时，仍难以在存活群体内发现结合高表达率与良好生长和稳定特性的合适生产克隆。本专利技术的一个目的是提高感兴趣产物在真核细胞例如尤其是哺乳动物细胞中的重组生产。具体地，本专利技术的一个目的是提供新型真核细胞系，其在用编码感兴趣产物的多核苷酸转染后，以提高的产率表达感兴趣产物。此外，一个目的是提供能鉴定表达特性改善的成功转染细胞的选择方法。另外，一个目的是提供重组生产感兴趣产物的改良方法。此外，一个目的是提供能在开发过程早期区分高产与低产重组细胞克隆和/或稳定与不稳定细胞克隆的分析工具。
技术实现思路
本公开尤其基于以下意外发现：例如通过减少或消除基因C12orf35在所述细胞中的功能表达，削弱基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果，可使感兴趣的重组产物在所述细胞中的表达显著增加。因此，鉴定了影响重组表达稳定性的关键基因。如本文所述，削弱基因C12orf35表达产物在细胞中的效果能通过增加表达产率来显著提高感兴趣产物的重组生产。因此，本专利技术对现有技术作出重要贡献。根据第一方面，本公开提供经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。削弱可例如通过减少或消除内源基因C12orf35在所述细胞中的功能表达来实现，例如通过基因沉默、基因缺失或通过突变基因，从而表达无功能蛋白或功能较少的蛋白。如实施例所示，瞬时或稳定转染后，各经改变真核细胞意外地能以更高产率生产感兴趣的重组产物。因此，这些真核细胞特别适合作为重组生产技术的宿主细胞并能用于重组生产感兴趣产物。根据第二方面，提供选择重组表达感兴趣产物的宿主细胞的方法，包括(a)提供第一方面所述真核细胞作为宿主细胞，其中所述宿主细胞包括至少一种编码感兴趣产物的外源多核苷酸；和(b)选择一或多个表达感兴趣产物的宿主细胞。根据第三方面，提供重组生产感兴趣产物的方法，包括使用第一方面所述真核细胞作为宿主细胞用于重组表达感兴趣产物。如上所述，由于其生产能力增加，这些新型真核细胞尤其适合作为宿主细胞用于重组生产。根据第四方面，提供适合重组产生感兴趣产物的真核细胞的生产方法，包括削弱内源基因C12orf35表达产物在真核细胞中的效果。这能例如通过减少或消除基因C12orf35在所述细胞中的功能表达来实现。根据第五方面，提供一种分析真核细胞作为宿主细胞重组表达感兴趣产物的适宜性的方法，所述方法包括直接或间接分析基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果是否受损。此方法可方便地使用，例如联合第四方面所述方法以鉴定例如是否获得真核细胞，其中基因C12orf35表达产物的效果受损。此外，该方法能用作分析工具以区分高表达与低表达克隆，且在多个实施方式中，区分表达感兴趣产物的稳定克隆与不稳定克隆。根据第六方面，本公开涉及经分离真核细胞在重组表达感兴趣产物中的应用，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。本申请的其它目的、特征、优点和方面通过以下说明书和所附权利要求对本领域技术人员来说是显而易见的。然而，应理解以下说明书、所附权利要求和特定实施例尽管指示本申请的优选实施方式，但仅作为例证给出。通过阅读以下内容，在所公开的专利技术精神和范围内的多种变化和修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的。附图说明图1提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体8端粒区和位于所述端粒区的基因的概述图。图中所示基因组区域是染色体8上合并拼接序列(scaffold)6和25号的结果。使用与Brinkrolf等(Nature Biotechnology卷31,694–695(2013)；参见基因库:APMK00000000,APMK01000000版，如所述出版物所述)的装配相关的基因库注释文件，可找到关于CHO细胞染色体8上基因和假定基因的概述。此外，北京华大基因公司还提供该区域的注释(Xu等,Nature Biotechnology,卷29,第8期,735-741(2011)；参见基因库:AFTD00000000,AFTD01000000版)。图1中用*标记的注释来自基因库文件AFTD01000000。小鼠染色体6端粒区的对应概述可参见例如Ensembl数据库。小鼠染色体6具有对应于中国仓鼠染色体8的结构。Ensembl数据库的以下链接显示小鼠染色体6端粒区，其含有C12orf35基因(在此称为2810474O19Rik)。http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Location/View？db＝core；g＝ENSMUS G00000032712；r＝6:149309414-149335658下表1提供图1所示基因和编码产物的缩写和别称(别名)的概述，并且(可能的话)指示小鼠和中国仓鼠的相应注释(根据Brinkrolf等,2013和/或Xu等,2011)。表1还列出所采用的别名，例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/919,3131.一种经分离真核细胞，其中基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果受损。2.如权利要求1所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述基因C12orf35表达产物的效果受损，因为基因C12orf35在所述细胞中的功能表达减少或消除。3.如权利要求2所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述基因C12orf35的功能表达通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或任意上述组合来减少或消除。4.如权利要求3所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述C12orf35基因包括C12orf35基因中的一个或多个突变作为基因突变，其提供无功能或功能较少的表达产物。5.如权利要求3或4所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述至少一个或所有基因C12orf35拷贝在真核细胞基因组中缺失或功能失活。6.如权利要求1-5中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是后生动物细胞、脊椎动物细胞或哺乳动物细胞。7.如权利要求6所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述真核细胞是哺乳动物细胞。8.如权利要求1-7中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，一部分染色体缺失，其中缺失部分包括基因C12orf35。9.如权利要求8所述的经分离真核细胞，其特征在于a)所述真核细胞是仓鼠细胞且至少一部分染色体8端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因C12orf35；或b)所述真核细胞是小鼠细胞且至少一部分染色体6端粒区缺失，其中所述缺失部分包括基因C12orf35。10.如权利要求9所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述缺失的端粒区包括基因C12orf35且包括一个或多个选自Bicd1、Amn1、甲基转移酶样蛋白20、Dennd5b、FAM60A、Caprin2、Ipo8和RPS4Y2的基因；b)所述缺失由染色体断裂诱导且断点位于Ipo8基因着丝粒，优选位于Tmtc1基因内；c)至少一部分端粒区在各染色体对的两条染色体中都缺失，其中缺失部分包括基因C12orf35。11.如权利要求1-10中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述真核细胞是啮齿动物细胞，b)所述真核细胞是仓鼠细胞，优选CHO细胞，c)所述真核细胞内源表达DHFR和叶酸受体，和/或d)所述真核细胞作为细胞克隆或细胞系提供。12.如权利要求1-11中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述C12orf35基因是编码与一个或多个SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列或SEQ ID NO:8编码蛋白共有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的蛋白的基因。13.如权利要求1-12中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，额外削弱蛋白FAM60A在所述细胞中的所述效果，优选通过减少或消除基因FAM60A的功能表达削弱。14.如权利要求13所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述FAM60A蛋白与一种或多种SEQ ID NO:11-18所示氨基酸序列共有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性。15.如权利要求1-14中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，a)基因C12orf35在所述细胞中的功能表达减少或消除且其中减少或消除引起感兴趣重组产物的体积生产相较基因C12orf35的功能表达未减少或消除的对应细胞增加；和/或b)改变真核细胞基因组以削弱基因C12orf35表达产物在所述细胞中的效果。16.如权利要求1-15中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，且其中优选编码感兴趣产物的异源多核苷酸整合入真核细胞基因组。17.如权利要求1-16中一项或多项所述的经分离真核细胞，其特征在于，所述细胞具有一个或多个以下特征：a)所述真核细胞包括整合入其基因组的至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸和至少一种编码选择标记或报告多肽的异源多核苷酸且其中所述异源多核苷酸位于相同或不同的表达载体；b)所述真核细胞包括编码叶酸受体作为选择标记的异源多核苷酸和/或包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的异源多核苷酸；c)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中所述感兴趣产物是多肽；d)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的异源多核苷酸，其中感兴趣产物是多肽且所述真核细胞分泌所述感兴趣多肽到细胞培养基中；和/或e)所述细胞包括至少一种编码感兴趣产物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·约斯托克，H·劳克斯，A·瑞特，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH