本发明专利技术公开了一种糖基转移酶突变蛋白及其应用。具体地，本发明专利技术利用同源比对以及定点突变，发现了一种新的糖基转移酶的突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有糖基转移酶催化活性，并且所述突变蛋白含有与酶催化活性相关的以下核心氨基酸：第142位氨基酸为A；第144位氨基酸为H或F；和第339位氨基酸为G；其中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO.:13所示的序列。实验证明，对糖基转移酶中的关键位点进行改造后，可以改变原本无活性或活性较差的酶，或者赋予新的酶活性。此外，本发明专利技术人还发现，对本发明专利技术糖基转移酶进行末端截短后，其表达量具有明显的上升。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和植物生物学领域，具体地，本专利技术涉及一种糖基转移酶突变蛋白及其应用。
技术介绍
人参皂苷是从人参及其同属植物(如三七、西洋参等)中分离到的皂苷的总称，属于三萜类皂苷，是人参中的主要有效成份。目前，已经从人参中分离出了至少100种皂苷。从结构上来看，人参皂苷是皂苷元经过糖基化后形成的生物活性小分子。人参皂苷的皂苷元只有有限的几种，主要是达玛烷型的原人参二醇和原人参三醇，以及齐墩果烷酸。皂苷元通过糖基化后，可以提高水溶性，并产生出不同的生理活性。原人参三醇在C3,C6和C20位都有一个羟基，目前发现的原人参三醇型皂苷都是在C6和(或C20)的羟基上结合糖基化，在C3上结合糖基的原人参三醇型皂苷尚未见报道。糖基可以是葡萄糖、鼠李糖、木糖、和阿拉伯糖。一些原人参三醇型皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值：包括抗过敏和抗炎症、免疫调节、抗疲劳、护心等功能。人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)属于原人参三醇型皂苷，它在人参中的含量也非常低，也属于稀有人参皂苷。人参皂苷F1的结构与CK非常接近，也是在皂苷元的C-20位羟基上连有一个葡萄糖基。人参皂苷F1也具有独特的药用价值。它具有抗衰老和抗氧化的功能。人参皂苷Rh1(6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)属于原人参三醇型皂苷，它在人参中的含量也非常低，也属于稀有人参皂苷。人参皂苷Rh1的结构与F1非常接近，但是它的糖基化位点是在C6位上的羟基。人参皂苷Rh1也具有特殊的生理功能，能够抗过敏和抗炎症。人参皂苷Rg1(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol)属于原人参三醇型皂苷，具有抗疲劳、护心等功能。稀有人参皂苷的糖基化修饰程度一般都比较低(只含有1-2个糖基)，而丰 富皂苷的糖基化修饰程度更高(由多个糖基组成的糖链)。稀有人参皂苷单体的传统生产方法，是以人参或者三七的总皂苷或者丰富皂苷为原料，依赖化学、酶和微生物发酵的水解方法。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参皂苷资源目前来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，所以，人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成稀有人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备稀有人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度稀有人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。利用合成生物学方法来人工合成这些具有药用活性的三醇型人参皂苷，不仅需要构建合成原人参三醇的代谢途径，还需要鉴定催化人参皂苷的糖基化的糖基转移酶。糖基转移酶的功能是将糖基供体(核苷二磷酸糖，例如UDP-葡萄糖)上的糖基转移到不同的糖基受体上。根据氨基酸序列的不同，目前糖基转移酶已有94个家族。目前已测序的植物基因组中，发现了上百种以上不同的糖基转移酶。这些糖基转移酶的糖基受体包括糖、脂、蛋白、核酸、抗生素和其它的小分子。因此，本领域需要对糖基转移酶进行更多的研究和开发，通过更多高产的糖基转移酶，以经济、高效的方式获取稀有人参皂苷。
技术实现思路
本专利技术提供了一种糖基转移酶的突变蛋白，通过采用所述的突变蛋白可以改善其酶活性或增加其表达量。本专利技术的第一方面，提供了一种糖基转移酶的突变蛋白，所述的突变蛋白为 非天然蛋白，且所述突变蛋白具有糖基转移酶催化活性，并且所述突变蛋白含有与酶催化活性相关的以下核心氨基酸：第142位氨基酸为A；第144位氨基酸为H或F；和第339位氨基酸为G；其中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO.:13所示的序列。在另一优选例中，所述的突变蛋白除142、144、339位氨基酸外，其余氨基酸与SEQ ID NO.:13所示的序列相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有糖基转移酶活性。在另一优选例中，与SEQ ID NO.:13所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。在另一优选例中，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:13、或16所示。在另一优选例中，所述的突变蛋白不是SEQ ID NO.:1、2或4所示的序列。在另一优选例中，所述糖基转移酶催化活性包括催化以下一种或多种反应：(a)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-20位的羟基；(b)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的羟基。在另一优选例中，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:6、11-12所示，且所述的糖基转移酶催化活性包括将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-20位以及C-6位的羟基。 在另一优选例中，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:6、8、11-12、16所示，且所述的糖基转移酶活性包括将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的羟基。 在另一优选例中，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:6-7、9-13所示，且所述的糖基转移酶活性包括将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-20位的羟基。 在另一优选例中，所述的糖基转移酶催化活性包括催化以下一种或多种反应：(A)其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，式(II)化合物为人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，所述的突变蛋白包括SEQ ID NO.:6-7、9-13；(B)其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，式(III)化合物为人参皂苷Rh1(6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)；或式(II)化合物是人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，式(IV)化合物是人参皂苷Rg1(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)；所述的突变蛋白包括SEQ ID NO.:6、8、11-12、16；(C)其中，所述式本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种糖基转移酶的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有糖基转移酶催化活性，并且所述突变蛋白含有与酶催化活性相关的以下核心氨基酸：第142位氨基酸为A；第144位氨基酸为H或F；和第339位氨基酸为G；其中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO.:13所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有糖基转移酶催化活性，并且所述突变蛋白含有与酶催化活性相关的以下核心氨基酸：第142位氨基酸为A；第144位氨基酸为H或F；和第339位氨基酸为G；其中，所述氨基酸位置编号基于SEQ ID NO.:13所示的序列。2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述糖基转移酶催化活性包括催化以下一种或多种反应：(a)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-20位的羟基；(b)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-6位的羟基。3.如权利要求1或2所述的突变蛋白，其特征在于，所述的糖基转移酶催化活性包括催化以下一种或多种反应：其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，式(II)化合物为人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，所述的突变蛋白包括SEQ ID NO.:6-7、9-13；其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，式(III)化合物为人参皂苷Rh1(6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，；或式(II)化合物是人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，式(IV)化合物是人参皂苷Rg1(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)；所述的突变蛋白包括SEQ ID NO.:6、8、11-12、16；其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，所述式(II)化合物是人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，式(IV)化合物为人参皂苷Rg1(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)，所述的突变蛋白包括SEQ ID NO.:6、11-12；其中，所述式(I)化合物是原人参三醇(protopanaxatriol)，所述式(II)化合物是人参皂苷F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，式(III)化合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，魏维，严兴，王平平，魏勇军，杨成帅，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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