Netrin‑4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途制造技术

本发明专利技术属细胞生物技术领域，涉及Netrin‑4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途；本发明专利技术通过实验显示所述Ntn4通过与其配体neogenin结合、激活Jak/Stat、PI3K/Akt和ERK/MAPK等多条促癌通路，进而发挥其促进胃癌细胞增殖及侵袭的效应；实验结果显示，所述Ntn4在胃癌患者血清样本及肿瘤组织样本中均显著高表达，且其高表达与患者生存期呈负相关，与TNM分期呈正相关，表明所述Ntn4可作为胃癌诊断及预后的潜在血清学指标，用于制备检测胃癌及预后标志物的制剂，包括用于检测胃癌及预后标志物的试剂或试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属细胞生物
，涉及Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途；其中，所述Netrin-4为一种与层粘连蛋白同源的分泌蛋白。
技术介绍
据报道，胃癌是常见恶性肿瘤之一，死亡率在世界上仅次于肺癌，高居癌症病死率的第二位。目前，由于临床诊疗水平的限制，尤其是缺少血清学诊断指标，多数胃癌患者确诊时疾病已达进展期，基本失去了根治性手术的机会。有研究显示，血清胃蛋白酶原、胃泌素-17或可用于胃癌早期筛查，但其特异性及灵敏性仍有待大样本数据验证。现有技术公开了Netrins是一个进化保守、与层粘连蛋白同源的分泌蛋白家族，其最初被认为是轴突导向调控分子，发挥调节轴突生长的作用；但最近有研究表明，所述netrins广泛表达于神经系统外组织，并参与多种生物过程，包括血管生成、淋巴管生成、肿瘤发生、细胞迁移、侵袭及粘附等。在哺乳动物体内，netrins系统至少包括5个配体(netrins 1,3,4,G1a和G1b)及7个潜在受体(DCC,neogenin,UNC5A-D和A2b)；其中，Nertrin-4(Ntn4)作为基底膜组成蛋白，表达于血管内皮及肾脏、乳腺和卵巢上皮的基底膜。研究还表明，所述Ntn4可调节肿瘤增殖和血管生成；在高侵袭性乳腺癌组织中，Ntn4表达明显升高，表明其可能促进肿瘤迁移及侵袭；此外，所述Ntn4还可通过激活MAPK,Akt/PI3K和mTOR信号通路促进淋巴管内皮细胞的增殖和迁移。有研究显示，Netrin受体在netrin信号转导中发挥主要作用；其中，所述Neogenin(Neo)是Ntn4的受体之一，其广泛表达于代谢活跃的组织，如胃肠道、肺及胰腺等。与Ntn4相似的是，Neo在高侵袭性肿瘤中存在高表达，且Neo被证明可促进胃癌细胞增殖和迁移；虽然有多项研究表明，Ntn4参与肿瘤发生、发展，但迄今其在胃癌中的作用尚未见文献报道，Ntn4是否可作为血清或血浆标志物用于胃癌的诊断和预后仍缺乏相应研究支持；此外，Neo是否在Ntn4对胃癌的效应中发挥作用及相应的分子机制仍不明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，针对胃癌诊断和预后缺乏有效的血清学指 标的现状，提供一种用于胃癌诊断及预后的潜在血清学及组织学指标，具体涉及Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途；本专利技术的另一目的是，提供一种胃癌治疗的潜在靶标，有助于临床实践中用以抑制胃癌细胞增殖及迁移。本专利技术通过实验结果显示，所述Ntn4通过与其配体neogenin结合、能激活Jak/Stat、PI3K/Akt和ERK/MAPK等多条促癌通路，进而发挥其促进胃癌细胞增殖及侵袭的效应；实验结果显示，所述Ntn4在胃癌患者血清样本及肿瘤组织样本中均显著高表达，且其高表达与患者生存期呈负相关，与TNM分期呈正相关，表明所述Ntn4可作为胃癌诊断及预后的潜在血清学指标，进一步，所述的Netrin-4可用于制备检测胃癌及预后标志物的制剂，如，用于检测胃癌及预后标志物的试剂或试剂盒。本专利技术进行了针对人胃癌细胞的试验，结果表明，下调Ntn4可显著抑制胃癌细胞增殖，和抑制胃癌细胞迁移及侵袭，过表达Ntn4能促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，以及，下调Ntn4的受体—neogenin可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，并且仅Neo存在的情况下Ntn4才能发挥其促进增殖和侵袭的作用；结果还表明，Ntn4与其受体Neo结合后促进细胞侵袭，Ntn4的促增殖和侵袭作用与JAK/Stat—PI3K/Akt—ERK/MAPK信号通路的激活有关，Ntn4在胃癌患者中高表达、且Ntn4表达升高则表明预后较差。本专利技术提供了一种用于胃癌诊断及预后的潜在血清学及组织学指标，进一步，所述的Netrin-4可用于制备检测胃癌及预后标志物的制剂，如，用于检测胃癌及预后标志物的试剂或试剂盒。本专利技术提供一种胃癌治疗的潜在靶标，有助于临床实践中用以抑制胃癌细胞增殖及迁移。附图说明图1显示了下调Ntn4对胃癌细胞株AGS和MGC803生长的影响，其中，A、B：实时定量PCR和ELISA法显示Ntn4的干扰效果良好，Ntn4的表达被siRNA显著下调；C、D：下调Ntn4可明显抑制AGS和MGC803细胞增殖；E：克隆形成实验显示下调Ntn4可显著抑制AGS和MGC803细胞克隆形成。图2显示了采用划痕实验检测下调Ntn4对胃癌细胞迁移的影响，其中，在划痕0、15、 24、48小时后拍照，测量划痕宽度，A：下调Ntn4后细胞划痕愈合速度减慢，愈合时间延长；B：用matrigel侵袭实验明确下调Ntn4是否影响细胞侵袭；C：相较转染siControl的AGS细胞，转染siNtn4-1和siNtn4-2减少了61％和63％的细胞穿透matrigel。图3显示了AGS和MGC803细胞转染pcDNA3和pcDNA3-Ntn4，实时定量PCR和ELISA检测转染效率，其中，A、B：转染pcDNA3-Ntn4后，Ntn4表达水平明显上升；C、D：CCK8试验显示过表达Ntn4可显著促进胃癌细胞增殖；E：划痕实验显示划痕24小时后，转染pcDNA3-Ntn4的AGS细胞较转染pcDNA3的细胞，其划痕宽度减少20％，即其划痕愈合速度加快，愈合时间减少；F-G：侵袭实验显示过表达Ntn4后，穿越matrigel的AGS和MGC803细胞数显著增加。图4显示了通过实时定量PCR对现在已知的netrin家族受体在AGS和MGC803的表达进行检测，包括Neo，DCC，UNC5A-D，其中，A：Neo在2种胃癌细胞系中均高表达；B：利用RNA干扰技术下调Neo的表达，通过western blot验证干扰效果，结果显示Neo表达被显著下调；C:CCK试验显示下调Neo可抑制AGS和MGC803细胞生长，72小时抑制率分别为32％和54％；D:在侵袭实验中，转染siNeo的AGS和MGC803细胞，其matrigel穿透率分别为对照的73.7％和69.5％，即下调Neo后，细胞侵袭性下降。图5A-B显示了CCK8试验显示过表达Ntn4促进AGS和MGC803细胞增殖，但同时下调Neo可逆转Ntn4的促增殖作用；C-E显示了下调Neo可逆转Ntn4的促细胞侵袭作用。图6A-C显示了当通过下调Ntn4或Neo表达来阻断Ntn4-Neo复合体的功能后，MMP2表达降低，TIMP1表达升高；相反，过表达Ntn4则导致MMP2表达升高，TIMP1表达降低；D-E显示了下调Ntn4 48小时后，Stat3、ERK、Akt和p38的磷酸化水平降低，而过表达Ntn4后，所述蛋白的磷酸化水平升高；F显示下调Neo表达也导致Stat3、ERK、Akt和p38的磷酸化水平降低。图7A显示了相较癌旁组织，Ntn4在肿瘤组织中表达显著升高；B根据染色强度由弱到强，将样品分为4个组，分别为弱染色组(+)、中度染色组(++)、强染色组(+++)和超强染色组(++++)；C：Ntn4在大多数胃癌组织样本中呈高表达，归于强染色组和超强染色组；在癌旁组织中呈弱表达，归于弱染色组和中度染色组(P＝0.001)；D：在胃癌病人血清中Ntn4水平显著高于正常对照(n＝52，P<0.0001本文档来自技高网...

【技术保护点】
Netrin‑4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测胃癌及预后标志物的制剂是检测胃癌及预后标志物的试剂。3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测胃癌及预后标志物的制剂是检测胃癌及预后标志物的试剂盒。4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Netrin-4与其配体neogenin结合、激活Jak/Stat、PI3K/Akt和ERK/MAPK促癌通路，促进胃癌细胞增殖及侵袭。5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，下调Ntn4的表达抑制胃癌细胞增殖...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，杨冬琴，吕彬，张骏，章琦，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31