本发明专利技术公开了莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物及应用。申请人基于新发现分子标记FMGBSS-I3设计了引物gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。该引物对可用于辅助鉴别莲藕中支链淀粉、直链淀粉、总淀粉及总干重含量关系，进而用于藕莲育种选择。本发明专利技术的方法可以在幼苗阶段筛选，对培育高（或低）淀粉、高（或低）直链或高（或低）支链淀粉的藕莲品种具有重要指导作用，可以加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，适于推广应用，为莲藕种质的鉴定和莲藕育种选择提供了一种快捷的选择方法，具有很高的开发和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
具体涉及莲藕淀粉相关基因GBSS(合成颗粒结合型淀粉合成酶)功能分子标记引物及应用
技术介绍
莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)是睡莲科多年水生草本植物，在中国、日本和东南亚国家和地区普遍种植。淀粉约占莲藕根状茎总干物重的70％，因此淀粉含量、淀粉组成及其组成特性直接影响莲藕的品质。根据淀粉含量不同，通常将莲藕分为两类：一类是脆质类型，目前中国加工出口的莲藕产品及适于日常炒食所用鲜藕，都属于这一类。该类型莲藕含水量和含糖量相对较高，而淀粉含量和粗纤维含量相对较低，食用脆嫩爽口；第二类为粉质类型，其主要特点是含水量较低，淀粉含量高，尤其支链淀粉所占比例大，煮食口感酥粉柔软，也适合加工藕粉。植物淀粉主要有直链淀粉和支链淀粉两类，影响莲藕加工品质的是以淀粉为主的碳水化合物和淀粉中直链淀粉、支链淀粉含量。直链淀粉是由α-1,4糖苷键连接而成的葡萄糖聚合体，它是一种线性大分子，没有或很少有分支；支链淀粉则是先由α-1,4糖苷键连接葡萄糖残基所形成的长链，再在长链上通过α-1,6糖苷分支键形成分支链而形成的葡萄糖聚合体，其分子量比直链淀粉大，淀粉合成酶(GBSS,Granule-Bound Starch Synthase)在此过程中起决定性作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物，其为：gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。该引物可用于鉴定莲藕中的淀粉含量。本专利技术的另一个目的在于提供了一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的应用，该应用包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，莲藕的早期育种筛选。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：申请人发现，GBSS等位基因中第三个内含子处出现了序列差异，特将该分子标记命名为FMGBSS-I3，针对该分子标记设计了引物如下：一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物其为：gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的应用，包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，
莲藕的育种筛选。该应用通过以下方式实现：利用引物gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。对莲藕DNA进行PCR扩增，扩增结果两条带为高淀粉含量的莲藕，扩增结果一条带为低淀粉含量的莲藕。具体请详见具体实施方式。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、本专利技术所用引物少，且效率高；并具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为莲种质资源的鉴定与莲藕育种选择提供了一种快捷的方法，具有很高的应用价值。2、本专利技术所用引物直接开发于GBSS基因上，基因序列的长度差异直接对应于品种的表型差异，可靠性更高。附图说明图1为引物gbf3和gbr3针对GBSS基因的设计位点。其中黑色加粗斜体为引物序列，灰度背景色为内含子序列，透明背景色黑色字体为外显子。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常规生化试剂商店购买得到的。实施例1：莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的获得：1、取45份成熟莲样品，利用常规技术测莲藕的支链淀粉占干物质百分含量、直链占干物质百分含量、总淀粉/干物质百分含量、支链淀粉占总淀粉含量和直链淀粉占总淀粉含量。见表1。表1莲藕样品的淀粉含量2、在NCBI中找出莲淀粉相关基因GBSS(合成颗粒结合型淀粉合成酶)的DNA序列和cDNA序列，blast比对，找出GBSS中的外显子和内含子序列，考虑到外显子选择压力大、变异小，所以最终将引物设计于外显子之上。设计了的引物如下表2。表2：基因GBSS外显子上设计的14对引物序列3、取45份莲样品的嫩叶用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取莲总DNA。具体如下：①取30mg莲干叶片，打磨成粉末。②将粉末迅速转移到装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。③加入700μL氯仿，充分混匀，12，000rpm离心5min。④小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12，000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12，000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。⑧重复操作步骤⑦。⑨将吸附柱CB3放入收集管中，12，000rmp离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加65μL的ddH2O,室温放置2-5min，12,000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中。4、在25μL的PCR体系中取上述稀释十倍的DNA提取液1μL，加入10μM的正向引物和反向引物各1μL，10mMol的dNTP(三磷酸碱基脱氧核苷酸)1.2μL，10×Taq Buffer(DNA聚合酶缓冲液)2.5μL，20mMol的Mg2+2μL，2U/μL的Taq酶0.5μL，加16.8μL的ddH2O。组分终浓度加入体积ddH2O-15.5μL10×Buffer(含20mmol/L Mg2+)1×2.5μLdNTP(25mmol/L)600μmol/L0.6μL引物(20μmol/L)均1.2μmol/L1.5μL(正反)Taq酶(2U/μL)2U1.0μLDNA(10ng/μL)14ng1.4μL反应液上加盖15μL矿物油(Sigma)，以防止反应过程中水分蒸发。5、PCR反应程序：94℃、4分钟，预变性45秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃终延伸8分种；4℃保存。6、将PCR扩增产物进行6％聚丙烯酰胺电泳。在25μLPCR扩增产物中加入10μL3×Loading Buffer，混匀后，在95℃变性5min，立即放至冰上冷却5min以上，得到样
品。每一个加样孔点入4μL样品(分子量标准为pBR322DNA/MspI)，在65W恒功率下电泳约60-80min。电泳结束后，进行银染显色。染色液由2g AgNO3、20mL HNO3和2L水组成，染色10-15min。显影液由40g NaOH、1mL 5％依来锘黑T和3mL 37％(体积百分含量)甲醛组成，至带纹出现。定影液为10％(体积百分含量)醋酸水溶液，定影5min。再用ddH2O漂洗5分钟。7、结果表明：在十四对引物中，只有第三对引物gbf3(正向)和gbr3(反向)扩增的PCR产物有长度多态性，GBSS等位基因中第三个内含子处出现了序列差异。8、在该多态性的条带中，将有一本文档来自技高网...
【技术保护点】
莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物，gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。
【技术特征摘要】
1.莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物，gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。2.权利要求1所述的分子标记引物在鉴定不同淀粉含量莲藕品系中的应用。3.权利要求1所述的分子标记引物在莲藕的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刁英，王剑雄，郑兴汶，胡中立，郑兴飞，谢克强，周明全，何建军，王有为，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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