一种组织切片可视化处理的方法技术

技术编号:13799032 阅读:135 留言:0更新日期:2016-10-07 00:36
本发明专利技术涉及生物技术领域,特别是涉及一种组织切片可视化处理的方法。一种组织切片可视化处理的方法,具体为将组织切片按顺序进行FISH和FIHC染色,包括如下步骤:1)FISH染色:使用针对目标基因I mRNA的标记探针、针对标记探针的一抗、针对一抗的放大溶液I对组织切片中目标基因I mRNA进行染色;2)FIHC染色:使用抗目标基因II蛋白质抗体、生物素化的二抗、HRP标记的链酶亲和素和放大溶液II对步骤1所得切片进行处理。本发明专利技术所提供的组织切片可视化处理方法,能更好地从时间上区分mRNA和蛋白质表达时程,并能更好地区分IEG mRNA和蛋白质信号,实现了IEG mRNA和蛋白质信号的定位,从而提供了一种对两种不同药物或行为的神经元应答模式以单细胞的精度进行定位的分子成像技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
,特别是涉及一种组织切片可视化处理的方法
技术介绍
尽管人们在理解大脑对外部世界的感官表现这一方面取得了重大进展,但不同刺激在大脑中表现的方式在很大程度上仍然是难以解释。主要的难点是,无论刺激是何种性质(在专利技术一实施例中,无论是喜好性的还是厌恶性的),所激活的许多大脑区域都是相同的。遗憾的是,无论是使用功能性磁共振成像、正电子发射计算机断层扫描还是单刺激即刻早期基因(IEG)定位,都无法确定激活是出现在许多共同激活的区域中的同样的神经元群中还是不同的神经元群中。开拓性的电生理学研究发现了不同大脑部位对喜好性信号和厌恶性信号的有趣的神经激活模式;但这些研究都是同时对一个大脑结构中的上百个神经元进行取样,因此仍然无法得知整个结构和整个大脑中的两个集群之间的空间关系。IEG(即刻早期基因),全称为immediate early gene,翻译为即刻早期基因。IEG可以作为活动神经元的标志。这是一类对刺激非常敏感的基因,在生物个体经历刺激后迅速表达,并且可以启动一系列的下游基因表达,从而介导个体对于刺激的反应。在刺激后,IEG的信使核糖核酸(mRNA)快速转录表达,然后mRNA出核开始翻译为蛋白质。mRNA先表达,先降解。蛋白质后表达,后降解。IEG包括一系列的基因,如c-fos,arc,zif268,c-jun,FosB,homer1等。如在论文中所示,IEG c-fos在动物静息状态下的足底电击环境表达很低,在受到刺激后快速表达,可以标记被该刺激所激活的神经元。用IEG标记神经元有个问题,它无法区分被一次刺激和另一次刺激所激活的神经元。因此我们利用的IEG的mRNA和蛋白质的表达和降解的时程差异,顺次给予动物两个刺激;在第一次刺激所引起的IEG mRNA已经降解,而蛋白质还处在高峰的时候取样,用IEG蛋白质信号来代表第一次刺激所激活的神经元;此时第二个刺激引起的IEG mRNA表达处于高峰,而且还没有开始翻译为蛋白质,因此可以用IEG mRNA来代表第二个刺激所激活的神经元。使用IEG mRNA和蛋白质共染的方法,可以直观地观察对两种不同刺激或者两种行为应答或激活的神经元表达模式,如本专利技术一实施例中所示有三种应答模式:分离式,重合式和交错式应答模式。用酪胺放大系统对蛋白质信号进行进一步放大,即本专利技术TAI-FISH,可以大大扩大IEG mRNA和蛋白质共染方法的应用范围,使之可以成为在神经系统调控模式或者疾病信号通路的标准办法。在很多刺激或行为和很多脑区,由于mRNA和蛋白质的降解时程并未有明显的分离,难以找
到合适的时间点取样;当使用酪胺放大系统对蛋白质信号进行放大后,大大提高了蛋白质和mRNA的分离程度,可以适用于大多数的刺激或行为和脑区。此外,由于TAI-FISH将两个刺激的间隔时间拉长,如本专利技术一实施例,两个刺激间隔4-6小时,也大大减小了两个刺激之间的相互干扰。
技术实现思路
本专利技术中专利技术人通过“酪胺放大的免疫荧光和荧光原位杂交共染”的新方法,提供了一种组织切片可视化的方法,来对组织切片上的两个刺激所激活的神经元进行单细胞级别的同步可视化。我们发现小鼠对于不同刺激所引起的神经元集群之间具有独特的互动模式,即:分离式、重合式和交错式。在伏隔核中,我们发现两种对应的信号引起了一种马赛克镶嵌式激活模式,并揭开了D1和D2类型的中型多棘神经元(这些神经元分别响应“跑”和“不跑”信号通道)中之前不受认可的功能异质性的面目。这些结果可作为一种用于对两种不同刺激所引起的行为进行同步功能定位的强大方法的原理的证据。鉴于现有技术的缺点,本专利技术的目的在于提供一种组织切片可视化处理的方法,并进一步提供所述组织切片可视化处理的方法的用途,用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的,本专利技术第一方面提供一种非诊断和治疗目的的组织切片可视化处理的方法,具体为将组织切片按顺序进行FISH(荧光原位杂交)和FIHC(荧光免疫组化)染色,包括如下步骤:1)FISH染色:使用针对目标基因I mRNA(信使核糖核酸)的标记探针、针对标记探针的一抗、针对一抗的放大溶液I对组织切片中目标基因I mRNA进行染色;所述标记探针、针对标记探针的一抗以及放大溶液I构成荧光原位杂交(FISH)体系,对组织切片中的mRNA进行染色和信号放大。优选的,所述FISH染色包括如下步骤:将清洗、乙酰化处理后的切片置于含针对目标基因I mRNA的标记探针的杂交液中孵育,杂交后清洗切片,使用RNase A处理后清洗切片,并进行封闭处理;使用针对标记探针的一抗处理经封闭处理后的切片,清洗后将切片置于放大溶液I中孵育,孵育完成后清洗切片;更优选的,所述步骤1中,清洗、乙酰化处理切片的具体步骤为:使用PBS对切片进行清洗,再使用含H2O2的PBS处理切片,然后使用PBS清洗切片,然后使用含曲拉通X-100的PBS对切片进行处理,并使用含乙酸酐(vol/vol)的三乙醇胺对切片进行乙酰化,然后使用PBS再进行清洗,将清洗后的切片置于不含探针的预杂交液中预杂交后,将切片移入含探
针的杂交液中进行杂交。本领域技术人员可根据经验选择选择适当的试剂盒和处理条件对切片进行处理。优选的,所述步骤1中,所述目标基因I选自即刻早期基因(IEG),更优选为c-fos、arc、zif268、c-jun、FosB、homer1等即刻早期基因,或PKC-δ、Drd1a、Drd2等其他研究者感兴趣的任意目的基因中的一种或多种的组合。本专利技术所提供的组织切片可视化处理的方法中,可使用本领域各种FISH染色系统对目标基因I的mRNA进行信号放大处理,只要不对本专利技术的专利技术目的产生限制即可。优选的,所述步骤1中,所述标记探针经地高辛-UTP或荧光素-UTP标记,所述针对标记探针的一抗为绵羊抗地高辛或绵羊抗荧光素抗体。其中经地高辛-UTP标记的标记探针对应绵羊抗地高辛抗体,荧光素-UTP标记的标记探针对应绵羊抗荧光素抗体。优选的,所述步骤1中,所述放大溶液I为经标记的酪胺溶液,所述放大溶液I可染色针对标记探针的一抗。更优选的,所述步骤1中,所述经标记的酪胺选自青色素3酪胺、青色素5酪胺、香豆素酪胺中的一种或多种的组合,在本专利技术一优选实施例中为青色素3酪胺。2)FIHC染色:使用抗目标基因II蛋白质抗体、针对抗目标基因II蛋白质抗体的信号放大系统对步骤1所得切片进行处理。所述抗目标基因II蛋白质抗体、针对抗目标基因II蛋白质抗体的信号放大系统构成荧光免疫组织化学(FIHC)体系,对组织切片中的目标基因II蛋白质进行染色和信号放大。优选的,所述FIHC染色包括如下步骤:使用抗目标基因II蛋白质抗体孵育步骤1所得切片,对过氧化物酶进行灭活后使用生物素化的二抗与抗目标基因II蛋白质抗体结合后,再将切片与HRP(辣根过氧化物酶)标记的链酶亲和素进行反应,再通过放大溶液II处理使蛋白质信号可视化。所述步骤1中放大溶液I与放大溶液II的种类不同。本专利技术所提供的中枢神经系统组织切片可视化处理的方法中,FISH染色针对一种目标基因I的mRNA,FIHC染色针对一种目标基因II蛋白质,FISH染色和FIHC染色步骤中的目标基因可以为同种基因,也可以为不同基本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种组织切片可视化处理的方法,具体为将组织切片按顺序进行FISH和FIHC染色,包括如下步骤:1)FISH染色:使用针对目标基因I mRNA的标记探针、针对标记探针的一抗、针对一抗的放大溶液I对组织切片中目标基因I mRNA进行染色;2)FIHC染色:使用抗目标基因II蛋白质抗体、生物素化的二抗、HRP标记的链酶亲和素和放大溶液II对步骤1所得切片进行处理;所述步骤1中放大溶液I与步骤2中放大溶液II的种类不同。

【技术特征摘要】
1.一种组织切片可视化处理的方法,具体为将组织切片按顺序进行FISH和FIHC染色,包括如下步骤:1)FISH染色:使用针对目标基因I mRNA的标记探针、针对标记探针的一抗、针对一抗的放大溶液I对组织切片中目标基因I mRNA进行染色;2)FIHC染色:使用抗目标基因II蛋白质抗体、生物素化的二抗、HRP标记的链酶亲和素和放大溶液II对步骤1所得切片进行处理;所述步骤1中放大溶液I与步骤2中放大溶液II的种类不同。2.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述FISH染色包括如下步骤:将清洗、乙酰化处理后的切片置于含针对目标基因I mRNA的标记探针的杂交液中孵育,杂交后清洗切片,使用RNase A处理后清洗切片,并进行封闭处理;使用针对标记探针的一抗处理经封闭处理后的切片,清洗后将切片置于放大溶液I中孵育,孵育完成后清洗切片。3.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述目标基因I选自即刻早期基因。4.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述目标基因I选自c-fos、arc、zif268、c-jun、FosB、homer1、PKC-δ、Drd1a、Drd2中的一种或多种的组合。5.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述标记探针经地高辛-UTP或荧光素-UTP标记,所述针对标记探针的一抗为绵羊抗地高辛或绵羊抗荧光素抗体。6.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述放大溶液I为经标记的酪胺溶液,所述放大溶液I可染色针对标记探针的一抗。7.如权利要求6所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述经标记的酪胺选自青色素3酪胺、青色素5酪胺、香豆素酪胺中的一种或多种的组合。8.如权利要求1所述的一种组织切片可视化处理的方法,其特征在于,所述FIHC染色包括如下步骤:使用抗目标基因II蛋白质抗体孵育步骤1所得切片,对过氧化物酶进行灭活后使用生物素化的二抗与抗目标基因II蛋白质抗体结合后,再将切片与HRP标记的链酶亲和素进行反应,再通过放大溶液II...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡海岚修建波张琪
申请(专利权)人:中国科学院上海生命科学研究院
类型:发明
国别省市:上海;31

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