对会感染人类的肠病毒具有特异性的抗体制造技术

本发明专利技术提供可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位的抗体或其片段，其中该抗体个别地包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链。还提供一种制造可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位的抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术关于对会感染人类的肠病毒具有特异性的抗体、其制造方法、及其用于治疗人类肠病毒感染的用途、以及作为疫苗制程控制，以决定特异性与效力标准。专利技术背景小核糖核酸病毒(小核糖核酸病毒科)是一个多样的病毒科，会引起多种常见疾病。在小核糖核酸病毒科中，肠病毒属的病毒对数种疾病是重要的，每年会影响全世界数百万人。非特异性发热性疾病是肠病毒感染最常见的表现之一。由肠病毒感染引发的其他著名的疾病包括脊髓灰质炎、胸膜痛、心包炎、心肌炎、心律失常、心肌梗塞与急性出血性结膜炎。肠病毒属的病毒通常在被感染者的呼吸道分泌物(如唾液，痰，或鼻粘液)和粪便中发现。从历史上看，脊髓灰质炎，由3种脊髓灰质炎病毒引起，是肠病毒引起的最重要疾病。然而，现在有将近一百种非脊髓灰质炎肠病毒可导致人类疾病；其中包括柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、埃可病毒、和许多其他肠病毒。不包括鼻病毒，引起人类疾病的肠病毒最近被重新划分为4个不同种类。脊髓灰质炎病毒和肠病毒71(EV71)，像许多其他肠病毒，是经由粪-口途径传播。感染可导致多种症状，范围从温和的呼吸道疾病(一般感冒)、手足口病、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、严重新生儿败血症样疾病与急性弛缓性麻痹。肠病毒感染是儿童无菌性脑膜炎的最常见原因。在美国，肠病毒引起30,000至50,000例脑膜炎。此外，2007年的一项研究提示，与肠病毒有关的急性呼吸道或胃肠道感染可能是慢性疲劳综合征的一个因素。人类肠病毒71和柯萨奇病毒A16(CA16)，为肠病毒血清型种A，其因为是手足口病(HFMD)的主要病因而引起注意。该病毒会随着粪便被排出，且还见于咽分泌物和水泡。传播与儿童间的密切接触有关，并经由环境污染传播。本病特征为急发热，并且在手掌、脚掌、臀部和膝盖出现疹子，以及在颊膜出现水疱，其通常会在7-10天内结束。只有一小部分HFMD患病儿童发展为严重的疾病。有些感染EV71的儿童会发展为脑炎，此为肠病毒感染的一种罕见表现。脑炎可导致永久性脑损伤，且可以致命。主要涉及神经系统和心血管系统表现为综合征的严重疾病，如脑膜炎、脑炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿和心脏衰竭，一般仅发生于EV71感染。在亚太地区最具破坏性的神经系统综合征为脑干脑炎，其死亡率为40-80％。患有重症HFMD的儿童可能需要几个月的时间才能恢复，而且在某些情况下，神经损害可能是永久性的。目前尚无HFMD的特异性抗病毒治疗，且无疫苗可预防脊髓灰质炎以外的肠病毒感染。EV71有时额外地与严重中枢神经系统疾病有关。其于1969年首度由在加州的神经系统疾病的案例分离出及被鉴定。至今，对于EV71感染的宿主反应的分子机制知之甚少，但已发现编码趋化因子、涉及蛋白质降解的蛋白质、补体蛋白、以及促凋亡蛋白的mRNA的水平会增加。虽然之后该病毒已于全球检测到，但最近HFMD在亚洲的区域流行病中已升高警戒，EV71更具致病性的形式可能会出现于该地区。第一个造成大量死亡的HFMD爆发疫情是在1997年的马来西亚沙捞越出现。与该爆发疫情有关的病毒为EV71。台湾于1998年的流行期间，报导129,106件HFMD病例，其中405例为严重疾病，且78例死亡。新加坡在2000-2001年期间，报导9000件案例，其中有7例死亡，从那以后，每两到三年反复流行一次。在2008年的前8个月，新加坡报导19,530件病例，以及1人死于HFMD。之后，EV71疫情在新加坡、泰国、马来西亚、台湾、日本、韩国、越南、中国、澳大利亚和菲律宾定期有报导。中国在2007年报导83,344件案例，其中有17例死亡，并在2008年的安徽省阜阳市经历了一次大爆发，且蔓延至中国许多地方。这些大爆发经由媒体广泛地报导，引发家长对于孩童健康的关注，且公共卫生部门试图通过关闭学校和日托中心打断传播链而引起了社会混乱。从那时起，中国每年都会有大爆发的报告。针对来自EV71壳体蛋白的肽而产生的单克隆抗体通常没有或具有低中和活性。Zhang等人(2012)产生针对氨基酸残基94至97的单克隆抗体，其在Western印迹法、免疫荧光法与ELISA中具反应性，但无法中和EV71病毒。Kiener等人(2012)描述针对VP2壳体肽(氨基酸142-146)的单克隆抗体，其特异性地与EV71反应，但无法中和病毒。市售的单克隆抗体MAB979(Merck Millipore)，其对VP2肽(氨基酸141至150)具反应性(Liu等人，2011)，可在滴度为<1:14时中和原型EV71(BrCr)。位于VP1壳体内的肽SP55(氨基酸163-177)和也位于VP1内的肽SP70(氨基酸208-222)可产生单克隆抗体，其无法中和EV71，或仅在低滴度如1:4或最佳1:16时进行中和(Li等，2009)。Lim等人(2012)描述2种单克隆抗体，是针对位于SP70肽(Li等人，2009)内的一种肽产生的，其共享共同的表位KQEKD。其中一种单克隆抗体可中和EV71，而另一种则不能。作者提示中和作用取决于抗体的同种型，在这种情况下，具IgM同种型的抗体可以中和，而IgG抗体则无法。IgM具10个结合位点，而IgG只有2个，这提示该中和活性是取决于抗体的阻断作用。由于上述抗体缺乏效力，因此需要提供更有效的具EV71特异性的单克隆抗体，以及制造可对抗EV71与其他小核糖核酸病毒的中和性抗体的方法。另外，EV71抗体为EV71疫苗发展中，制程控制与效力测定所需要的，且还可用于帮助定义EV71抗体效力标准。专利技术概述本专利技术寻求解决上述问题，并提供具肠病毒71(EV71)特异性的抗体。依照本专利技术的一个优选方面，提供至少一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至EV71的至少一种构象(非线性)表位。在一个优选实施方案中，该抗体或其片段可包含至少一种可变轻链氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:1、其变异体、突变体或片段，以及至少一种可变重链氨基酸序列，包含SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:1至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ ID NO:2至少90％序列同一性的序列。在一个优选实施方案中，该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:15、其变异体、突变体或片段。依照另一个优选实施方案，该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。在一个优选实施方案中，该抗体包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ ID NO:3至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含至少一种具有与SEQ ID NO:4或5至少90％序列同一性的序列。在一个优选实施方案中，该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:16、17与18的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及该重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:19、20、21与22的至少一者、其变异体、突变体或片段。依照又一个优选实施方案，该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离的抗体或其片段，可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.16 MY PI20130045131.一种经分离的抗体或其片段，可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。2.依照权利要求1的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ ID NO:3至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含至少一种具有与SEQ ID NO:4或5至少90％序列同一性的序列。3.依照权利要求1或2的经分离的抗体或其片段，其中该可变轻链包含SEQ ID NO:16、17与18的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含SEQ ID NO:19、20、21、与22的至少一者、其变异体、突变体或片段。4.一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或15、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或片段。5.依照权利要求4的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:1或15至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ ID NO:2至少90％序列同一性的序列。6.一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至EV71的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:6、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、其变异体、突变体或片段。7.依照权利要求6的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ ID NO:7至少90％序列同一性的序列。8.依照前述权利要求任一项的经分离的抗体或其片段，其中该抗体为中和性抗体或其片段。9.依照前述权利要求任一项的经分离的抗体或其片段，其中该抗体为单克隆小鼠、人类、人源化或嵌合抗体。10.依照权利要求1至9任一项的经分离的抗体或其片段，其用于EV71疫苗制程控制、候选EV71疫苗纯化、或决定EV71抗体效力标准。11.一种医药组成物，其包含权利要求1至9任一项中定义的至少一种抗体或其片段。12.依照权利要求1至9任一项的经分离的抗体或其片段，其用于EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的治疗。13.依照权利要求12的经分离的抗体或其片段，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。14.权利要求1至9任一项中定义的至少一种抗体或其片段用以制备用于治疗EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的药物的用途。15.依照权利要求14的用途，其中该药物包含权利要求6中定义的人源化抗体，以及一或多种前述定义的其他抗体。16.依照权利要求14或15的用途，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。17.一种治疗EV71感染及/或至少一种EV相关疾病的方法，该方法包含对受试者施用权利要求1至9任一项中定义的抗体或其片段。18.依照权利要求17的方法，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。19.一种制造具小核糖核酸病毒特异性的抗体的方法，该方法包含：对至少一个非人类哺乳动物免疫接种至少一个未成熟小核糖核酸病毒颗粒，以形成至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；选择出至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；融合选择出的B细胞与至少一个永生化细胞，以产生至少一个杂交瘤，其中该杂交瘤可制造具小核糖核酸病毒特异性的至少一种抗体或其片段；以及任选地自该杂交瘤中分离出该抗体，并对可变重链与轻链测序。20.依照权利要求19的方法，其中该未成熟小核糖核酸病毒颗粒包含空的小核糖核酸病毒颗粒。21.依照权利要求19或20的方法，其中该未成熟小核糖核酸病毒颗粒包含该小核糖核酸病毒的至少一种病毒蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛琍·J·卡杜莎，
申请(专利权)人：MAB探索私人有限公司，
类型：发明
国别省市：马来西亚;MY