本发明专利技术涉及可优化病毒复制的培养基，所述培养基中含有浓度为100-1000nM的融合蛋白E，所述细胞系为过表达融合蛋白E基因的宿主细胞系。本发明专利技术提供的融合蛋白E，可提高多种病毒TCID50效价1-3个lg单位，HA效价2-4个lg2单位，包括冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒以及疱疹病毒等，且在使用剂量内无细胞毒性，突破了DNA病毒与RNA病毒之间的界限，以及病毒有无囊膜的界限。通过原核表达系统获得的融合蛋白E表达效率较高，且易于纯化，一步纯化效率可达85％以上，蛋白终浓度可达3mg/ml。通过将融合蛋白E直接加入病毒培养基中，可提升多种病毒疫苗滴度效价，简便快捷，本发明专利技术在病毒学科的产、学、研诸多方面均具有重大的影响和意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及全病毒疫苗制备领域，具体地说，涉及一种可优化病毒复制的培养基。
技术介绍
全病毒疫苗(包括弱毒苗与灭活苗)在现代疫苗应用中占据相当大的比重。全病毒疫苗又被称为常规疫苗，包括灭活疫苗与减毒活疫苗。其中，人类疫苗包括腮腺炎减毒活苗、乙脑减毒苗、甲肝减毒活疫苗、狂犬弱毒苗、手足口病灭活苗、轮状病毒灭活苗、甲型肝炎灭活苗、乙脑灭活苗等。动物疫苗的使用更为普遍，同时考虑到成本与给药方便，一般常制备成多联苗，最典型的就是犬五联苗，即犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副流感五种病毒弱毒的细胞培养冻干苗(30元/支)。然而实际研发过程中，最常遇到苗毒效价低的问题，导致疫苗的成本居高不下。此外，非全病毒疫苗的疗效也并不令人满意，有时采用亚单位疫苗或基因工程疫苗免疫后，仍无法控制疾病的发生发展，加之许多新发病的病原致病机理不甚清楚，因此最直接有效的方法就是同时免疫弱毒疫苗或灭活苗，可获得稳定可靠的免疫效果。这些现状促使研究者持续重视开发减毒活疫苗或灭活苗，并认为如果不存在严重不良反应，全病毒疫苗仍为首选，当然，考虑到致病表型逆转的风险，对其安全性的要求更加严格。此外，许多病毒学实验室经常遇到的技术瓶颈是，很多病毒(如肠道病毒以及某些新发现病毒)很难甚至根本无法在常用细胞系内增殖，以至于很多病毒学试验无法跟进，也因此直接影响后续研究。因此，如何不通过遗传改造法，提高病毒复制力，是病毒学科领域面临的重大挑战之一。目前全病毒疫苗制备领域也面临相似的难题，很多疫苗用毒株效价不高，这直接影响着疫苗的效果与价格。国内外一些研究小组尝试在病毒培养过程中通过多次换液以降低细胞对病毒的防御影响(如干扰素浓度)；还有研究者尝试将不同细胞系的贴壁细胞改良成悬浮细胞，以通过增加单位体积的细胞密度，提升细胞增殖病毒的效价滴度。这些方案一定程度上提高了病毒的效价滴度，然而皆属于外部因素的改造，而且操作繁琐，并没有通过深入了解病毒复制的宿主因素，从根本上发现并开发有利于病毒复制的可利用细胞内资源。细胞核仁蛋白P60，是胶质瘤抑癌候选基因2(Glioma tumor suppressor candidate region gene 2,GLTSCR2)编码蛋白，可调节肿瘤抑制因子P53与PTEN的稳定性，在肿瘤学领域，P60拥有“肿瘤抑制因子”及“抑制癌症的路障”双重身份。P60独特的生化特性与复杂功能使之迅速成为科研热点，但是在病毒学领域，鲜见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可优化病毒复制的培养基。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种新型的融合蛋白E，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。研究发现，P60蛋白(如Seq ID No.3所示的氨基酸序列)可提高6科类不同病毒TCID50效价2-3个lg单位，包括冠状病毒(如传染性支气管炎病毒)、副粘病毒(如犬瘟热与新城疫病毒)、正粘病毒(如禽流感病毒)以及疱疹病毒(人单纯疱疹病毒-1和马立克病毒)。但P60的细胞毒性限制其直接应用。进一步研究发现，P60蛋白不同片段的功能差异显著。本专利技术是在P60蛋白的研究基础上，通过筛选其关键作用域，构建融合蛋白以制备出稳定的可提升多种不同科类病毒苗毒效价滴度的培养基，同时构建过表达所述蛋白的稳定细胞系。蛋白毒性实验结果表明，P60全蛋白可诱导显著的细胞凋亡，且细胞毒性较
明显，而融合蛋白E在100μM浓度以下对细胞无毒性作用。应当注意的是，本领域技术人员知晓，当将本专利技术所述的Seq ID No.1所示的氨基酸序列中的6个His标签去掉后获得的蛋白具有与Seq ID No.1所示的氨基酸序列同等的生物学功能，因此同样属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供编码所述融合蛋白E的基因，所述基因具如Seq ID No.2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供含有编码所述融合蛋白E基因的载体。本专利技术融合蛋白E的制备方法包括以下步骤：1)基因克隆：以胶质瘤抑癌候选基因2(GenBank:KJ898763.1)为模板，设计引物进行目的基因的亚克隆；其中，上游引物：5'-CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'(Seq ID No.4所示的氨基酸序列)，下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'(Seq ID No.5所示的氨基酸序列)；2)载体构建：将pET-28a载体用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切，将步骤1)获得的目的基因同样用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切后与载体连接，得到含有目的基因的重组载体pET-E；3)细胞转化与表达：用重组载体pET-E转化BL21(DE3)，37℃摇床培养至OD590为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4h获得诱导后的菌体；4)蛋白纯化：诱导后的菌体经5000r/min离心15min，超声裂解菌体后离心取上清，将上清通过经PBS平衡的镍亲和层析柱，再用20mM咪唑洗涤层析柱10个柱体积，然后用3个柱体积的250mM咪唑洗脱液洗脱，得到含有6个His标签的融合蛋白溶液。然后用截流分子量为10KD的蛋白超滤管进行浓缩，得到纯化的融合蛋白E。其中，20mM咪唑的配方为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl，20mM咪唑；250mM咪唑洗脱液的配方为：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM
咪唑。本专利技术还提供所述融合蛋白E在制备灭活疫苗和/或减毒活疫苗以及病毒复制中的应用。前述的应用，其是通过在宿主细胞中过表达编码所述融合蛋白E的基因，并用病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株接种宿主细胞，培养细胞，收获病毒液。前述的应用，其是通过向用于制备病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗的宿主细胞培养液，或鸡胚培养液中添加融合蛋白E，使宿主细胞培养液或鸡胚培养液中融合蛋白E的浓度为100-1000nM，然后接种病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株，培养后收获病毒液。本专利技术涉及的病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株包括但不限于冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、呼肠孤病毒科以及疱疹病毒科。例如，禽流感病毒AIV、传染性支气管炎病毒IBV、犬瘟热CDV、新城疫病毒NDV、人单纯疱疹病毒HSV-1、马立克病毒MDV、肠道病毒EV71等。本专利技术还提供一种可优化病毒复制的培养基，所述培养基中含有浓度为100-1000nM的融合蛋白E。可选的，所述培养基为含有融合蛋白E的DMEM培养基。例如，所述培养基可以是将所述融合蛋白E加入含有2-5％血清的DMEM培养基中制备获得的。本专利技术所述的培养基中还可以含有本领域在生产病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗时常用的添加物。本专利技术还提供一种可优化病毒复制的细胞系，所述细胞系为过表达编码融合蛋白E基因的宿主细胞系。本专利技术提供的融合蛋白E，可提高多种病毒TCID50效价1-3个lg单位，HA效价2-4个lg2单位，包括冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒以及疱疹病毒，且在使用剂量内无细胞毒性，突破了DNA
与RNA病毒的界限。原核系统表达的蛋白表达效率较高，且本文档来自技高网...
【技术保护点】
融合蛋白E，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
2014.10.17 CN 20141055341281.融合蛋白E，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述融合蛋白E的基因。3.含有权利要求2所述基因的载体。4.权利要求1所述融合蛋白E的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)基因克隆：以胶质瘤抑癌候选基因2为模板，设计引物进行目的基因的亚克隆；其中，上游引物：5'-CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'，下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'；2)载体构建：将pET-28载体用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切，将步骤1)获得的目的基因同样用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切后与载体连接，得到含有目的基因的重组载体pET-E；3)细胞转化与表达：用重组载体pET-E转化BL21，37℃摇床培养至OD590为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4h获得诱导后的菌体；4)蛋白纯化：诱导后的菌体经5000r/min离心15min，超声裂解菌体后离心取上清，将上清通过经PBS平衡的镍亲和层...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓佳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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