本发明专利技术提供了一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，通过不同蛋白因子组合体外预处理间充质干细胞，找到最佳因子配比从而快速增强间充质干细胞的免疫调节能力。经过本发明专利技术所述的短时间预处理方法，间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节能力得到明显增强，从而有助于强化其对于自身免疫性疾病和免疫紊乱相关疾病的临床治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞
，具体地说，涉及增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)是来源于发育早期中胚层的一类重要的成体干细胞，具有多种组织修复能力，已广泛用于临床治疗研究。MSCs最初是由骨髓基质中分离获得的非造血多能干细胞，现已证实MSCs也存在于脂肪组织、脐带等多种组织内。研究表明间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)一个重要应用是免疫调节领域。大量研究证实，MSCs在体内可诱导免疫抑制，减少造血干细胞移植治疗过程中的GVHD及排斥反应，以及抗炎调节能力。MSCs的免疫抑制能力在大量的动物试验和临床研究中得到证实。Jarvinen等[Giles JT,Bartlett SJ,Gelber AC,et al.Tumor necrosis factor inhibitor therapy and risk of serious postoperative orthopedic infection in Rheumatoid Arthritis.Arthritis Care Res 2006,55:333–337.]发现肺细胞来源的MSCs在体外培养时不表达免疫刺激分子CD80、CD86，将MSCs加入非特异性丝裂原刺激的T细胞中，发现T细胞增殖显著受抑制。Corcione等[Corcione A,Benvenuto F,Ferretti E.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions.Blood 2006,107(1):367-372]将骨髓间充质干细胞与B细胞体外共培养实验发现B细胞的增殖被抑制在细胞周期的G0/G1期，不能诱导凋亡的发生。Sotiropoulou等[Sotiropoulou PA,Perez SA,Gritzapis AD.Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells.Stem Cells 2006,24(1):74-85]研究骨髓间充质干细胞对NK细胞作用的实验中发现在NK/骨髓间充质干细胞比例较低时，骨髓间充质
干细胞(BM-MSCs)改变了NK细胞的表型，抑制了NK细胞的增殖、细胞因子的分泌以及对HLA-I表达靶物的细胞毒性作用。然而，MSCs在免疫调节领域的应用仍存在一些问题亟需解决。首先，由于来源不同、细胞分离扩增的方法存在差异，MSCs的质量也存在很大差异，因此导致不同实验室的MSCs其调节免疫效果差异较大。另外，由于细胞治疗本身的特点，MSCs在治疗某些自身免疫性疾病方面的效果仍存在不确定性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有间充质干细胞免疫调节能力的不确定性，建立一套有效的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理培养方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外培养3-4天，换成预处理培养液，并向培养液中添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。所述重组炎性细胞因子为胞因子为素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：白细胞介素-2： 500-2000IU/ml肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml干扰素-γ： 10-20ng/ml。所述预处理培养液为DMEM/F12，并按体积比加入2％胎牛血清，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。优选，P2代间充质干细胞体外培养3-4天，向预处理培养液添加下述重组炎性细胞因子，预处理48小时，获得处理后的间充质干细胞；白细胞介素-2： 1000IU/ml肿瘤坏死因子-α： 20ng/ml干扰素-γ： 15ng/ml。本专利技术的有益效果是：通过本专利技术的方法，经IL-2、TNF-α或IFN-γ等
多种因子组合预处理的MSCs，可显著抑制经植物血凝素-P(PHA-P)激活的外周血淋巴细胞。多种因子组合的预处理可显著增强MSCs的免疫抑制能力。通过检测间充质干细胞培养上清液发现经过预处理的间充质干细胞分泌PGE-2的能力显著增强。附图说明图1是体外培养的间充质干细胞形态、分化能力分析。A为BM-MSCs细胞形态，B为BM-MSCs成脂及成骨诱导分化结果。图2是BrdU吸收法检测间充质干细胞体外抑制淋巴细胞反应。图3是经IL-2、TNF-α或IFN-γ等蛋白因子处理的MSCs免疫调节能力分析。图4是ELISA分析经预处理的MSCs表达TGF-β1、HGF、HLA-G5及PGE-2水平。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：本专利技术的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外培养3-4天，换成预处理培养液，并向预处理培养液中添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。所述重组炎性细胞因子为白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：白细胞介素-2： 500-2000IU/ml肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml干扰素-γ： 10-20ng/ml。所述预处理培养液为DMEM/F12，并按体积比加入2％胎牛血清，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。优选，P2代间充质干细胞体外培养3-4天，向培养液添加下述重组炎性细胞因子，预处理48小时，获得处理后的间充质干细胞；白细胞介素-2： 1000IU/ml肿瘤坏死因子-α： 20ng/ml干扰素-γ： 15ng/ml。实施例1间充质干细胞形态、分化能力及免疫表型第2代骨髓来源间充质干细胞体外正常传代培养至P2代，基础细胞培养液为DMEM/F12，培养基中加入10％胎牛血清(体积比)。培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中静止培养。待细胞克隆长至80％融合时，0.05％胰酶消化传代至新培养瓶中。对细胞进行细胞形态、分化能力、免疫表型等分析，确定细胞是否达到质量要求。结果发现间充质干细胞呈长梭形细胞贴壁，并可形成细胞克隆，如图1A所示。经免疫表型分析发现，间充质干细胞高表达黏附分子，如整合素(CD29)；受体分子，如玻璃质酸(CD44)，表面酶(CD73)；血管黏附分子(CD106)和I类主要组织相容性抗原(HLA-ABC)，而不表达内皮标志(CD31)；造血标志(CD34，CD45)和II类主要组织相容性抗原(数据未显示)。对细胞进行成脂及成骨诱本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外正常培养3‑4天，换成预处理培养液，并添加重组炎性细胞因子，预处理48‑72小时后，获得处理后的间充质干细胞。
【技术特征摘要】
1.一种增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，将达到质量要求的P2代间充质干细胞体外正常培养3-4天，换成预处理培养液，并添加重组炎性细胞因子，预处理48-72小时后，获得处理后的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的增强间充质干细胞免疫调节能力的预处理方法，其特征在于，所述重组炎性细胞因子为白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ中的两种或三种组合，向预处理培养液中添加量为：白细胞介素-2： 500-2000IU/ml肿瘤坏死因子-α： 10-20ng/ml干扰素-γ： ...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，
申请(专利权)人：睿尔天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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