改良的芽孢杆菌宿主制造技术

本发明专利技术提供中性蛋白酶生产和碱性蛋白酶生产有缺陷的芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。所述宿主细胞可有利地用于生产目标化合物的方法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及新的芽孢杆菌宿主细胞、生产所述宿主细胞的方法、利用所述宿主细胞生产目标化合物的方法、所述宿主细胞在生产目标化合物的方法中的用途。专利技术背景芽孢杆菌(Bacillus)菌株生产并分泌大量有用的蛋白质和代谢产物。由于它们的GRAS(一般认为安全)状态，芽孢杆菌宿主，例如属于Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis种的芽孢杆菌宿主，被广泛用于生产食品、饲料和制药行业的重要蛋白质。应用芽孢杆菌宿主表达异源性目标蛋白或者过表达同源性目标蛋白中的常见问题与所述宿主细胞中编码与目标蛋白一起共表达的一些细胞外蛋白酶的基因的存在有关。对于对蛋白酶降解敏感的那些异源性目标蛋白，芽孢杆菌中同源性蛋白酶的共表达导致产率损失，而同源性芽孢杆菌目标蛋白被所述共表达的芽孢杆菌蛋白酶污染，从而导致纯化问题。芽孢杆菌宿主中主要的细胞外蛋白酶是细胞外中性蛋白酶(又名芽孢杆菌溶素(bacillolysin)EC 3.4.24.28)和碱性蛋白酶(又名枯草杆菌蛋白酶EC 3.4.21.62)。通过使用所述细胞外中性蛋白酶和碱性蛋白酶有缺陷的芽孢杆菌菌株能够解决通过芽孢杆菌菌株的有用蛋白质的生产中由细胞外蛋白酶引起的的问题(参见例如Kawamura等人(Journal of Bacteriology,(1984)第442-444页，其描述了细胞外中性蛋白酶(nprE)和碱性蛋白酶(aprA)的结构基因有缺陷的Bacillus subtilis的突变菌株。芽孢杆菌菌株中存在的其它基因显示出降低所述生产宿主中目标蛋白的生产力。US 7,585,674公开了：宿主细胞(例如，芽孢杆菌细胞)中目标蛋白或多肽的生产力可以通过使所述宿主细胞的基因组缺失参与孢子形成阶段II、III、IV或V的特定基因来改善。然而，仍然需要增加芽孢杆菌宿主中蛋白质的表达的方法。专利技术概述出乎意料地已发现：当编码目标蛋白的目标基因与噬菌体启动子(优选噬菌体SPO1启动子)可操作地连接从而允许目标蛋白在宿主细胞中表达时，中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞可被用于以高产率生产目标蛋白。因此，本专利技术提供中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。在本说明书全文中，术语“中性蛋白酶”旨在表示根据酶学委员会编号被归类为EC 3.4.24.28的酶。在本说明书全文中，术语“碱性蛋白酶”旨在表示根据酶学委员会编号被归类为EC 3.4.21.62的酶。本专利技术还提供生产根据本专利技术的重组芽孢杆菌宿主细胞的方法，所述方法包括：a.提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷；b.利用核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许多核苷酸在宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体启动子序列，更优选地噬菌体SPO1启动子序列。本专利技术还提供生产目标化合物的方法，所述方法包括：a)在有益于生产目标化合物的条件下，培养根据本专利技术的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据用于生产根据本专利技术的重组宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞，和b)任选地，从培养液中分离所述目标化合物。本专利技术还提供根据本专利技术的重组芽孢杆菌宿主细胞或者根据用于生产根据本专利技术的重组宿主细胞的方法所生产的重组芽孢杆菌宿主细胞在生产目标化合物中的用途。附图简介图1展示了xynA表达质粒pDBC4XAS-1的示意图。图2展示了摇瓶中在SMM培养基中的菌株BS154XAS-1(ΔaprE和ΔnprE)以及BS1A40XAS-1(aprE+和nprE+)随时间的相对的木聚糖酶的生产。图3展示了整合表达载体pDBC1的物理图谱。BsmBI位点被用于将CAP标记换成启动子片段和目标基因。amyE侧翼区域之间的区域整合在amyE基因座并基于壮观霉素选择整合体(integrand)。图4展示了基于pDBC1载体的xynA表达整合载体pDBC1G01XAS-1的示意图。图5展示了24深孔板中在SMM培养基中的菌株BS154G00XAS-1(amyQ启动子)、BS154G01XAS-1(G01表达模块中的P15启动子)和BS154G02XAS-1(G02表达模块中的P15启动子)的相对的木聚糖酶的生产。图6展示了载体pGB20的示意图。图7展示了载体pDBC5的示意图。图8展示了用于PamyQ-AMY1在B.subtilis基因组的amyE基因座的不含标记整合的载体pDBC5AMY1的示意图。amyQ启动子和mobU RBS位于NotI和NdeI位点之间，amyE之间的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(amyM)侧翼是neoR、bleo(芽孢杆菌中赋予腐草霉素抗性的基因)、repE(温度敏感性ori)。图9展示了24深孔板中在SMM培养基中的菌株BS154AMY1(amyQ启动子)、BS154G03AMY1(表达模块G03中的P15启动子)、BS154G04AMY1(表达模块G04中的P15启动子)、BS154G05AMY1(表达模块G05中的P15启动子)、BS154G06AMY1(表达模块G06中的P15启动子)、BS154G07AMY1(表达模块G07中的P15启动子)、BS154G01XAS-1(表达模块G01中的P15启动子)和BS154G02XAS-1(表达模块G02中的P15启动子)的相对的葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶的生产。序列表说明SEQ ID NO:1展示了B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE4(本文称为P15启动子)的序列。SEQ ID NO:2展示了B.subtilis噬菌体SPO1的启动子PE5的序列。SEQ ID NO:3展示了xynA基因的5’侧翼区的正向引物的序列(包括AleI和PacI位点)。SEQ ID NO:4展示了xynA基因的3’侧翼区的反向引物的序列(包括HindIII位点)。SEQ ID NO:5展示了编码Bacillus subtilis中的碱性蛋白酶的基因aprE的多核苷酸序列。SEQ ID NO:6展示了由SEQ ID NO:5的aprE基因编码的Bacillus subtilis中的碱性蛋白酶AprE的氨基酸序列。SEQ ID NO:7展示了编码Bacillus subtilis中的中性蛋白酶NprE的基因nprE的多核苷酸序列。SEQ ID NO:8展示了由SEQ ID NO:7的nprE基因编码的Bacillus subtilis中的中性蛋白酶NprE的氨基酸序列。SEQ ID NO:9展示了包含TthIIII位点、340bp 5’-amyE、BsmBI位点、氯霉素选择本文档来自技高网...

【技术保护点】
中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体SPO1启动子序列，优选地包含根据SEQ ID NO:36的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:36的同一性为至少70％的多核苷酸序列的噬菌体SPO1启动子序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.07 EP 14154317.31.中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产有缺陷的重组芽孢杆菌宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体SPO1启动子序列，优选地包含根据SEQ ID NO:36的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:36的同一性为至少70％的多核苷酸序列的噬菌体SPO1启动子序列。2.生产根据权利要求1所述的重组芽孢杆菌宿主细胞方法，所述方法包括：a.提供芽孢杆菌宿主细胞，所述芽孢杆菌宿主细胞在中性蛋白酶生产和/或碱性蛋白酶生产上有缺陷，任选地在中性α-淀粉酶生产上有缺陷，任选地在孢子形成相关基因上有缺陷；b.利用核酸构建体转化所述芽孢杆菌宿主细胞，所述核酸构建体包含编码目标化合物或者编码参与目标化合物合成的化合物的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子序列可操作地连接从而允许所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达，其中所述启动子包含噬菌体SPO1启动子序列。3.根据权利要求1的宿主细胞或者根据权利要求2的方法，其中所述噬菌体SPO1启动子是根据SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的同一性为至少70％的多核苷酸序列，优选地所述噬菌体SPO1启动子是PE4或PE5，更优选地根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。4.根据权利要求1或3的宿主细胞或者根据权利要求2或3的方法，其中所述噬菌体SPO1启动子序列是表达模块的一部分，所述表达模块包含所述噬菌体SPO1启动子、mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列以及编码RBS的序列，更优选地所述表达模块包含位于所述启动子下游和编码RBS的序列上游的mRNA稳定化元件和/或经修饰的rib前导序列。5.根据权利要求4的宿主细胞或者根据权利要求4的方法，其中所述mRNA稳定化元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CryIIIA mRNA稳定化元件，优选地根据SEQ ID NO:48-54的mRNA稳定化元件，更优选地grpE mRNA稳定化元件，甚至更优选地根据SEQ ID NO:49的mRNA稳定化元件。6.根据权利要求4或5的宿主细胞或者根据权利要求4或5所述的方法，其中所述经修饰的rib前导序列是包含ribO突变C85T的rib前导序列，甚至更优选地其是包含ribO突变C85T的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列，甚至更优选地含有在SEQ ID NO:55的相应位置的ribO突变C85T和对应于SEQ ID NO:55的第166-263位核苷酸的核苷酸缺失的根据SEQ ID NO:55的rib前导序列。7.根据权利要求1或3-6中任一项的宿主细胞或者根据权利要求2-6中任一项的方法，其中所述表达模块具有选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35的多核苷酸序列。8.根据权利要求1或3-7中任一项的宿主细胞或者根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞属于选自B.agaradherens、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.atrophaeus、B.brevis、B....

【专利技术属性】
技术研发人员：埃弗特·特吉尔德·里杰·范，玛蒂娜·施帕安斯，翰德里克斯·伯纳德斯·卡罗勒斯·希勒布兰德，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL