一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法技术

本发明专利技术属于地质科研结合分子生物学技术领域，具体涉及一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法。将研究前期采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩心样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；DNA片段的提取；目的基因PCR增殖；目的基因的纯化，去除杂质DNA；基因连接；基因克隆；基因验证；菌种培养基和铀试剂的配制；微生物的分离和培养；微生物与铀富集的关系研究。本发明专利技术涵盖从野外地质观察到实验内提纯模拟的各个阶段，定性分析了微生物与铀成矿的关系，过程规范化和可信度高，方法合理可行，对于深化砂岩型铀成矿作用机理、判定微生物与铀成矿的关系具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于地质科研结合分子生物学
，具体涉及一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法。
技术介绍
微生物成矿作为生物成矿作用的一个分支是当今地学的前沿科学，也是国际成矿作用研究领域的新动向、新热点。微生物成矿作用是指微生物及其代谢作用所产生的有机质参与成矿或分异、聚集元素形成矿床或矿化菌体自身直接堆积形成有用矿产的作用。研究表明砂岩型铀矿床中微生物与铀的沉淀富集关系密切，但现有技术在微生物富集铀的人工合成方面仍属空白。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题为：现有技术难以完成微生物富集铀的人工合成。本专利技术采用了如下技术方案：一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，该方法具体包括以下步骤：(1)将采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；(2)DNA片段的提取，经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程得到高纯度的DNA样本；(3)目的基因PCR增殖，PCR包括变性、退火和延伸三个基本反应步骤；(4)目的基因的纯化，去除杂质DNA；(5)基因连接；(6)基因克隆；(7)基因验证；(8)菌种培养基和铀试剂的配制；(9)微生物的分离和培养；(10)微生物与铀富集的关系研究。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(2)中能够使DNA充分溶解的盐浓度为2mol/L，将钠磷酸盐、MT缓冲溶液和含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，将装样完成的裂解基质管在12000g条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来，完成粗提；使用蛋白质沉淀剂PPS将蛋白质同DNA进行分离；使用DNA吸附质配合乙醇洗液去除粗提样品中的硅酸盐物质。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(3)中PCR技术包括：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火和延伸三过程，将增殖好的DNA样品用荧光染料进行染色，然后将样品放入到填充有分离树脂的点泳池内进行电泳，30min后检测电泳池中的荧光分布情况，将带有荧光的部分
切割下来。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(4)中，将经过PCR复制后的树胶取出，放入到一只离心管中，向离心管中加入Buffer DEA，离心去除树脂，保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer DEA和Buffer DEB，离心重洗，弃滤液保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer W2，离心并重复操作；将DNA制备管重置于一只离心管中，向制备管中加入高纯水并离心；弃DNA制备管，保留离心管中的滤液。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(5)中，取一只离心管，分别加入Buffer 2PL、T载体、步骤(4)中的滤液和T4连接酶，在-80℃温度条件下静置，完成基因连接。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(6)中，将静置的样品取出解冻，然后将全部液体转移到装有大肠杆菌离心管中，向该离心管中注入CaCl2溶液；溶液混合均匀后在冰冻条件下静置；将静置好的溶液在42℃的恒温水浴锅中加热；向离心管中加入SOC培养基，在恒温室中以120r/min固定速率震动保存；将反应好的样品转移到加有氨苄的培养皿中，并用涂抹棒把样品涂抹均匀；恒温培养16个小时。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(7)中，将培养好的样品取出，在可见光条件下找出培养基上白色的菌群，并用移液枪枪尖选取白色菌种；将提取的白色菌种转移到另外一只培养基上的指定位置，然后再培养16个小时。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中所述的步骤(8)中，培养基配方：KH2PO4 0.5g、NH4CI 1.0g、CaCI2.2H2O 0.1g、Na2SO4
1.0g、MgSO4、7H2O 2.0g、乳酸钠3.5ml、酵母抽提物1.0g、维生素C 0.1g、巯基乙酸钠0.1g、FeSO4.7H2O 0.5g，按培养基配方称量好培养基所需药品；称取5mg铀加热溶于浓硝酸，直至液体变为淡黄色，无铀矿粉末存在为止，将溶解后的铀溶液与之前称量药品混合，加蒸馏水至1L，调节ph至7.5。所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其中在37℃条件下，将步骤(9)中得到的单菌落微生物与步骤(8)中得到的含铀溶液混合20天；得到了混合样品制片观察；将混合样品经2.5％的戊二醛溶液固定，经蒸馏水和分别为30％、50％、70％、80％、90％梯度浓度酒精清洗和脱水后，置冷冻干燥机内真空烘干；将所得样品进行沾台，喷金，然后在扫描电镜下观察。本专利技术的有益效果是：本专利技术的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，涵盖从野外地质观察到实验内提纯模拟的各个阶段，定性分析了微生物与铀成矿的关系，过程规范化和可信度高，方法合理可行；对于深化砂岩型铀成矿作用机理、判定微生物与铀成矿的关系具有重要作用。附图说明图1为本专利技术的砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法流程图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法作进一步说明。实施例1一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，包括野外采取实验样品、实验室内提取微生物DNA进行铀成矿模拟实验两个阶段，具体步骤如下：步骤1将研究前期采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯
样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中。步骤2DNA片段的提取：DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的盐溶液中溶解度不同，利用这一特点选择盐浓度为2mol/L就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，以达到分离目的；DNA在盐溶液中的溶解度先增大后减小，在DNA溶解度最低时，DNA从溶液中析出，而其他杂质还留在溶液中，达到粗提取的目的；粗提的DNA中往往带有大量的蛋白质，使用蛋白质沉淀剂可以有效的将蛋白质同DNA进行分离；因为所提取的DNA来自岩芯样品，所以使用DNA吸附质配合乙醇洗液可以去除粗提样品中的硅酸盐物质；经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程能够得到高纯度的DNA样本。具体步骤如下：步骤2.1将978μl钠磷酸盐缓冲溶液加入到裂解基质管中；步骤2.2向裂解基质管中加入122μl的MT缓冲溶液；步骤2.3将500mg含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，完成装样过程；步骤2.4将装样完成的裂解基质管在12000转/秒条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来；步骤2.5将上层清夜转移到容积为2ml的洁净离心管中，加入250μl P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：(1)将采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；(2)DNA片段的提取，经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程得到高纯度的DNA样本；(3)目的基因PCR增殖，PCR包括变性、退火和延伸三个基本反应步骤；(4)目的基因的纯化，去除杂质DNA；(5)基因连接；(6)基因克隆；(7)基因验证；(8)菌种培养基和铀试剂的配制；(9)微生物的分离和培养；(10)微生物与铀富集的关系研究。

【技术特征摘要】
1.一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：(1)将采集的层间氧化带砂岩型铀矿床含矿层的新鲜钻孔岩芯样品，剔除泥皮后装入经灭菌箱灭菌处理的样品中；(2)DNA片段的提取，经过粗提、蛋白质沉淀和去硅酸过程得到高纯度的DNA样本；(3)目的基因PCR增殖，PCR包括变性、退火和延伸三个基本反应步骤；(4)目的基因的纯化，去除杂质DNA；(5)基因连接；(6)基因克隆；(7)基因验证；(8)菌种培养基和铀试剂的配制；(9)微生物的分离和培养；(10)微生物与铀富集的关系研究。2.根据权利要求1所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(2)中能够使DNA充分溶解的盐浓度为2mol/L，将钠磷酸盐、MT缓冲溶液和含有微生物粉末样品加入到裂解基质管中，将装样完成的裂解基质管在12000g条件下离心15min，使DNA从细胞中裂解出来，完成粗提；使用蛋白质沉淀剂PPS将蛋白质同DNA进行分离；使用DNA吸附质配合乙醇洗液去除粗提样品中的硅酸盐物质。3.根据权利要求2所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(3)中PCR技术包括：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的
\t双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火和延伸三过程，将增殖好的DNA样品用荧光染料进行染色，然后将样品放入到填充有分离树脂的点泳池内进行电泳，30min后检测电泳池中的荧光分布情况，将带有荧光的部分切割下来。4.根据权利要求3所述的一种砂岩型铀矿床中微生物与铀成矿关系的研究方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，将经过PCR复制后的树胶取出，放入到一只离心管中，向离心管中加入Buffer DEA，离心去除树脂，保留DNA制备管中的沉淀；将DNA制备管重新置入一只离心管中，加入Buffer DEA和Buffer DEB，离心重洗，弃滤液保留DNA制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉燕，修晓茜，刘红旭，范洪海，
申请(专利权)人：核工业北京地质研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11