一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成；或者含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的，具有抗凝血活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有抗血栓作用，而且出血风险小，可作为制备治疗和预防血栓性疾病的药物应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域。具体地说，本专利技术涉及一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其在制备治疗和预防血栓性疾病中的应用。技术背景血栓栓塞性疾病是危害人类健康的常见病，也是当前社会致死致残的主要原因之一。传统的抗栓药物如肝素、低分子量肝素、华法林、血小板聚集抑制剂(如阿司匹林)、水蛭素等在临床应用中均具有较好的抗栓药效，但他们却还存在一定的不足，其中，最常见、最严重的并发症(副作用)是引起出血，因此，专利技术出血副作用小的抗栓新药具有非常重要的价值。近年来的研究表明：凝血过程中的凝血因子十一(coagulation factor XI，FXI)及血浆激肽释放酶(plasma kallikrein，PK)是出血风险小的抗栓防治新靶点[Bane CE Jr，Gailani D.Factor XI as a target for antithrombotic therapy.Drug Discov Today.2014，19(9)：1454-8；Renné T，Gruber A.Plasma kallikrein：novel functions for an old protease.Thromb Haemost.2012，107(6)：1012-3]，FXIa或FXI、血浆激肽释放酶(PK)抑制剂可能开发为出血副作用小的抗栓药物。Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类含有Kunitz结构域的多肽或蛋白类抑制剂，是目前研究最多的丝氨酸蛋白酶抑制剂之一[罗玉娇，李滨，舒衡平，蒋立平.Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展.中国生化药物杂志.2012，33(3)：316-9]。Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有复杂多样的功能，如具有抗炎、抗菌或抗虫等作用，目前已有牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)等Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂作为药物进入临床应用。生物体内分布有大量的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前在Genbank中登记的含有Kunitz型结构域的蛋白/多肽已超过1万多条。我们从美洲钩虫(Necator americanus)中获得了一种含有Kunitz型结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Necatorin，Necatorin及其经氨基酸残基替换、缺失或添加而形成的突变体具有较强的抗凝作用，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。Necatorin及其突变体对FXIa、或PK有很强的抑制作用。动物实验表明：Necatorin及其突变体能抑制血栓 形成，而且出血副作用小。因此，Necatorin及其突变体是一种具有出血副作用小的抗凝多肽，可应用于制备预防和治疗血栓性疾病药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗凝活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可应用于制备药物以治疗和预防血栓性疾病，并且具有出血副作用小的优点。本专利技术提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂含有由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽，或者含有由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽经过一个或多个氨基酸残基的替代、缺失或添加而形成的，且能明显延长APTT，而对PT基本无影响。本专利技术提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该抑制剂含有由SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4、或SEQ ID NO.5、或SEQ ID NO.6、或SEQ ID NO.7、或SEQ ID NO.8、或SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10、或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成的多肽，这些多肽能明显延长APTT，而对PT基本无影响。本专利技术提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其对FXIa或PK有很强的抑制作用。其中，由SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的多肽对激活的凝血因子十一(FXIa)及血浆激肽释放酶(PK)两者均有较强的抑制作用，由SEQ IDNO.4、或SEQ ID NO.5、或SEQ IDNO.6、或SEQ ID NO.7、或SEQ ID NO.8、或SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10、或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成的多肽较SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽对FXIa抑制作用有增强或无明显变化，但抑制PK的能力明显减弱，即抑制FXIa的特异性明显增强了。本专利技术的一个应用在于应用提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂制备治疗和预防血栓性疾病药物。包含本专利技术的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的抑制血栓形成作用，而且对出血时间无明显影响，可用于作为或发展成为出血副作用小的抗血栓约物。本专利技术的其它方面由于本文
技术实现思路
的公开，对本领域专业技术人员是易于理解并实施的。例如，包含本专利技术所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它抗栓药物联合用药可减少出血副作用，包含本专利技术所述的多肽药物组合物在临床中的应用，包含本专利技术的 多肽药物与白蛋白等偶联或融合以提高药物半衰期，包含本专利技术的抗凝多肽在作为抗凝制剂中的应用。本专利技术提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的优点是：该种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂不但能够制备作为有效治疗和预防血栓性疾病药物应用，而且出血副作用小，对于解决目前临床抗栓药物治疗出现的出血副作用具有重大价值。附图说明以下附图仅旨在于对本专利技术做示意性说明和解释，并不限定本专利技术的范围。其中，图1显示的是Necatorin对APTT及PT的影响，X轴数值为Necatorin浓度(nM)，Y轴数值为凝血时间(秒，sec)，Necatorin延长APT T的活性与其浓度呈依赖关系；图2显示的是Necatorin的核苷酸序列及其编码氨基酸序列，上方序列为核苷酸序列，下方为氨基酸残基(简写)序列，“*”示终止，下划线部分序列为预测的信号肽序列。具体实施方式下面结合具体实例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。凡是依照本专利技术公开内容所做出的等同替换，均属于本专利技术的保护范围。实施例1：Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的获得与制备在Genbank中登记的美洲钩虫基因组测序数据中，一种预测为具有Kunitz型结构域的多肽/蛋白(GenBank：ETN84717.1)由62个氨基酸残基组成，但其仅含有4个半胱氨酸残基(cys)，提示该Kunitz型结构域还不不完整。多种已知的美洲钩虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂信号肽具有较保守序列“MK/RFLLFLL”，因此我们利用已知的美洲钩虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(GenBank：ETN75126.1及GenBank：ETN82803.1)的cDNA序列设计上游引物5’-ATGAAATTTCTGCTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于含有：(a)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽；或者(b)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的、且能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间，但不延长凝血酶原时间。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于含有：(a)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽；或者(b)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的、且能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间，但不延长凝血酶原时间。2.如权利要求1所述的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述的替换、缺失或添加而形成的多肽含有：由SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4、或SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫永炎，
申请(专利权)人：莫永炎，
类型：发明
国别省市：广东;44