急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因、评估ALL耐药复发风险的试剂盒以及筛选治疗或预防ALL耐药复发的药物的方法。该突变基因是PRPS1突变基因。本发明专利技术为儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的预防和治疗提供了有力的技术手段和支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用。
技术介绍
儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是儿童期常见的恶性血液系统肿瘤疾病，是我国儿童因病死亡的重要原因之一。尽管在过去几十年经过众多努力后，儿童ALL的治疗和预后已有显著改善，但仍有15％～20％的患儿会复发，一旦复发，治愈率不足40％，复发一直是造成儿童ALL治疗失败和死亡的首要因素。复发问题日益成为国内外儿童ALL研究的热点和焦点。儿童ALL治疗过程中，化疗是诱导缓解和缓解后治疗的主要手段之一。目前临床上常用的化疗药物通常是利用核苷酸类似物破坏DNA、RNA的合成，从而导致DNA损伤诱导肿瘤细胞凋亡。儿童ALL诱导缓解阶段，通过大剂量药物的联合化疗，有90％的病人会得到缓解，缓解后会通过低剂量的化疗药物来维持治疗，在维持治疗期主要是通过口服6-巯基嘌呤(6-MP)或6-巯鸟嘌呤(6-TG)，肿瘤细胞需要耐受6-MP/6-TG的作用才会积累复发。最近Adolfo Ferrando和William L Carroll的研究小组利用二代测序技术对耐药复发的白血病患者的样本进行检测，发现复发的ALL细胞中的5’-核苷酸酶II(NT5C2)基因存在突变，该基因负责编码与核苷酸及核苷酸类似药物6-巯基嘌呤(6-MP)和6-巯鸟嘌呤(6-TG)的代谢相关酶，在ALL耐药复发中的突变比例约为10％。儿童ALL的耐药复发并非是一个基因的单碱基突变可以解释的，寻找复发相关的遗传学变异仍是目前儿童ALL耐药复发研究的重点和难点，与之相应的检测与治疗手段也因此比较缺乏。PRPS1基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶，是细胞内嘌呤代谢合成途径的
第一个限速酶。PRPS1催化5-磷酸核糖和ATP的反应，生成AMP和PRPP(5-磷酸核糖-1-焦磷酸)。PRPP经过一系列酶催化反应后生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，IMP进一步转变为(d)ATP和(d)GTP等DNA和RNA合成的原料。细胞内PRPP的含量过高或者过少，都可能引起以它为底物或者调节物的代谢通路异常，导致疫病的发生。目前发现PRPS1的突变与疾病相关，如非综合症型遗传性感音神经性耳聋(X-linked nonsyndromic sensorineural deafness,DFN2)、进行性神经病性肌萎缩综合症(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease-5,CMTX5)等。PRPS1突变有功能获得性突变(Gain of function)，如D183H、A190V、D52H等，也有功能缺失性突变(Reduced function)，如A87T、M115T、I290T等。但到目前为止在肿瘤中PRPS1还没有发现突变。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题：针对现在儿童ALL的耐药复发检测与治疗手段的较为缺乏的问题，本专利技术提供了一组急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因群及其在评估儿童ALL耐药复发风险中的应用。本专利技术对后续临床的复发早期的基因诊断和个体化治疗有重要的指导意义。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：(一)本专利技术提供了PRPS1作为急性淋巴细胞白血病耐药复发的基因标志物的用途。本专利技术还提供了一种PRPS1突变体，所述PRPS1突变体的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2所示的序列中下述位点发生氨基酸的替换突变后形成，所述替换为：第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰胺替换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190位丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第303位苏氨酸替换为丝氨酸、第53位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、
第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸或第174位甘氨酸替换为谷氨酸。所述第103位丝氨酸替换为苏氨酸的突变体在本专利技术中被表示为S103T，其他突变体的表达方式与此相同，依次为S103N、N144S、K176N、L191F、D183E、A190T、T303S、V53A、I72V、C77S、D139G、Y311C、S103I、N114D或G174E。本专利技术提供一种PRPS1突变基因，所述突变基因编码上述氨基酸序列的PRPS1突变体。本专利技术中，所述的PRPS1突变基因，可以如本领域常规，由于碱基的简并性，只要能够编码上述氨基酸序列的PRPS1突变体即可。所述突变基因的DNA序列较佳地为如序列表SEQ ID No.1所示的序列中下述位点发生核苷酸的替换突变后形成，所述替换为：第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G替换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C、第908位C替换为G、第158位T替换为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A替换为G、第932位A替换为G、第308位G替换为T、第340位A替换为G或第521位G替换为A。所述第308位G替换为C在本专利技术中表示为G308C，其他替换与此类似，分别为G308A、A431G、G528C、C549G、G568A、G573C、C908G、T158C、A214G、G230C、A416G、A932G、G308T、A340G或G521A。本专利技术提供一种包含如本专利技术所述PRPS1突变基因的重组载体。所述重组载体为本领域常规，较佳地为能表达所述PRPS1突变基因的原核表达载体或真核表达载体，更佳地为能表达所述PRPS1突变基因的慢病毒表达载体，最佳地为GV303慢病毒表达载体(吉凯基因)。所述真核表达载体的制备方法为本领域常规，较佳地为通过下述方法制得：将慢病毒表达载体用限制性内切酶线性化，通过clontech公司的In-FusionTMPCR Cloning Kit试剂盒将将PCR扩增PRPS1突变基因所得的产物交换入所述线性化的慢病毒
载体，通过大肠杆菌TOP10扩增重组子，形成含有本专利技术PRPS1突变基因的重组载体。本专利技术提供一种包含所述重组载体的转化体。所述转化体为本领域常规，只要能满足重组载体可稳定地自行复制，且所携带的本专利技术的PRPS1突变基因可被有效表达即可，较佳地为表达本专利技术PRPS1突变基因的原核细胞或真核细胞，更佳地为表达本专利技术PRPS1突变基因的真核细胞，最佳地为表达本专利技术PRPS1突变基因的Reh细胞系；所述转化体的制备方法为本领域常规，较佳地为使用表达本专利技术PRPS1突变基因的慢病毒载体包装成为慢病毒后感染所述真核细胞制得，最佳地为使用表达本专利技术PRPS1突变基因的慢病毒载体GV303(吉凯基因)与病毒包装的辅助质粒共转HEK293T细胞系包装成慢病毒后感染真核细胞Reh，再经流式细胞仪分选绿色荧光阳性的细胞制得。(二)本专利技术还提供了一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变体群，所述PRPS1突变体群包括以下PRPS1突变体：其氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
PRPS1作为急性淋巴细胞白血病耐药复发的基因标志物的用途。

【技术特征摘要】
1.PRPS1作为急性淋巴细胞白血病耐药复发的基因标志物的用途。2.一种PRPS1突变体，其特征在于，所述PRPS1突变体是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的序列中下述位点中的任意一个位点发生氨基酸的替换突变后形成的，所述替换突变为：第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰胺替换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190位丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第303位苏氨酸替换为丝氨酸、第53位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸或第174位甘氨酸替换为谷氨酸。3.一种PRPS1突变基因，其特征在于，所述PRPS1突变基因编码如权利要求2所述PRPS1突变体。4.如权利要求3所述PRPS1突变基因，其特征在于，所述PRPS1突变基因的核苷酸序列为如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中下述位点中的任意一个位点发生替换突变后形成，所述替换突变为：第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G替换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C、第908位C替换为G、第158位T替换为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A替换为G、第932位A替换为G、第308位G替换为T、第340位A替换为G或第521位G替换为A。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求3或4所述PRPS1突变基因。6.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求5所述重组载体。7.一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变体群，其特征在于，所述PRPS1突变体群包括以下PRPS1突变体：其氨基酸序列如
\t序列表中SEQ ID No.2所示的序列中第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰胺替换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190位丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸或第303位苏氨酸替换为丝氨酸。8.如权利要求7所述PRPS1突变体群，其特征在于，所述PRPS1突变体群还包括以下PRPS1突变体中的一种或多种：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的序列中第53位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸、第174位甘氨酸替换为谷氨酸或第190位甘氨酸替换为缬氨酸。9.一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变基因群，其特征在于，所述PRPS1突变基因群包括以下PRPS1突变基因：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的序列中第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G替换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C或第908位C替换为G。10.如权利要求9所述PRPS1突变基因群，其特征在于，所述PRPS1突变基因群还包括以下PRPS1突变基因中的一种或多种：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的序列中第158位T替换为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A替换为G、第932位A替换为G、第308位G替换为T、第340位A替换为G、第521位G替换为A或第569位C替换为T。11.一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，其特征在于，其包括：检测如权利要求9或10中所述PRPS1突变基因群中的PRPS1突变基因的试剂和使用说明书。12.如权利要求11所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增PRPS1
\t基因各外显子的引物、DNA聚合酶、dNTP或缓冲液中的一种或多种。13.如权利要求12所述试剂盒，其特征在于，所述使用说明书记载的内容包括以下步骤：(1)抽提样本基因组DNA；(2)检测步骤(1)所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因。14.如权利要求13所述试剂盒，其特征在于，步骤(2)中，所述检测步骤(1)所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因的方法包括：以步骤(1)所得的样本基因组DNA为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李本尚，李慧，王升跃，周斌兵，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海;31