一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用。本发明专利技术的多肽是：其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1，或SEQ ID N0.1所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可以是氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。本发明专利技术的SEQ ID N0.1多肽可以构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。而本发明专利技术所涉及的各多肽可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂或药物中的应用。本发明专利技术筛选多肽为化学合成，经刺激DC后可释放出高浓度的IL‑4，可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，或制备L7/L12蛋白单克隆抗体的抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多肽，特别是一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用。
技术介绍
布鲁氏菌（Brucella)，革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，是严重的人兽共患病，广泛感染家畜、野生动物和人，家畜动物布鲁氏菌主要感染羊、牛和猪，其中对人致病的主要有马耳他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌；布鲁氏菌病感染家畜引起公畜的附睾炎和怀孕家畜的流产、胎盘炎症和不育；对于人类，布鲁氏菌病课引起急性炎症和许多类似流感感染的症状，包括波浪热、多汗、背疼和体质虚弱，在一些病人身上，急性临床症状可持续一年以上最终导致慢性的持续性感染，慢性临床症状包括不规则的发热、关节疼、乏力，并发引起关节炎、区部末梢神经炎症、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎，布鲁氏菌病的流行不仅危害着畜牧业的发展，造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的健康和公共卫生安全。目前，全世界用于预防布鲁氏菌病的有效疫苗均为减毒的活疫苗，各种疫苗的使用不仅干扰着疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断，而且所有的疫苗株不同程度的对人有致病毒力，甚至有些疫苗对人为强致病力，安全可靠的灭活疫苗研究效果差，不能起到免疫保护作用。基因工程疫苗的研究近几十年来一直被全世界研究人员所关注和努力，但由于布鲁氏菌本身免疫抗原多样化，结构复杂，未能发现可用于田间试验的疫苗抗原，寻找存在于各种布鲁氏菌种间保守存在且具有很好免疫功能的蛋白，研制预防保护力高的亚单位疫苗是解决这一问题的有效办法。现有技术中大多数表达工具只能表达一种蛋白，而布鲁氏菌存在多种与免疫相关的蛋白，研究表明单个蛋白的表达不能形成有效的保护疫苗用抗原，表达制备多个防控作用的亚单位疫苗成本高，且组合成分复杂；而决定免疫蛋白功能的成分是位于蛋白上微小的抗原决定簇，对免疫相关蛋白免疫抗原表位的挖掘和鉴定，可以有效的提取布鲁氏菌中有效的免疫抗原成分，同时也对蛋白的结构和功能研究提供直接的指导，表位抗原成分的确定，可为检测、预防或治疗能提供良好的抗原组分。因此筛选获得免疫蛋白上这些抗原决定簇多肽为解决现有技术存在的不足提供了一种思路和途径。
技术实现思路
本专利技术提供一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其用途。本专利技术的布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1。本专利技术的布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽可以是其氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可以是氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。由序列SEQ ID N0.1可以构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。而本专利技术所涉及的各多肽可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂或药物中的应用。由序列SEQ ID N0.1可以形成一种用于治疗或预防布鲁氏菌的药物组合物。布鲁氏菌L7/L12蛋白是核糖体的组成部分，辅助核糖体与GTP包裹转录因子发生作用，使转录精确发生，研究证明L7/L12蛋白与布鲁氏菌免疫相关，是布鲁氏菌基因工程疫苗的候选抗原。本专利技术利用生物信息学的手段，对布鲁氏菌L7/L12免疫蛋白氨基酸的组成和功能进行分析，并模拟构建出蛋白的高级结构模型，综合上述结果发掘出的蛋白上潜在的具有免疫功能的抗原多肽，化学合成这些多肽后，通过实验验证手段最终获得功能多肽，制备出的布鲁氏菌L7/L12免疫蛋白多肽为布鲁氏菌病的检测、疫苗、防控提供新的思路，这也对于提高我国动物布鲁氏菌病的防治技术水平，保证养殖业健康发展、提供农牧民收入、保证公共卫生和畜产品安全同样具有重大的社会效益。本专利技术的有益效果为：1）本专利技术筛选多肽为化学合成，而不是活的布鲁氏菌上提取，因此在生产过程中完全避免了人为的制毒、散毒等安全隐患。2）本专利技术采用生物信息学工具与试验验证相结合筛选抗原多肽，缩小的筛选抗原多肽的范围，提高了筛选效率。3）本专利技术在树突状细胞上筛选抗原多肽，由于树突状细胞具有强大的抗原加工和递呈能力，结果更为接近于动物模型。4）本专利技术所获得的多肽能与布鲁氏菌病阳性血清发生反应，故该重组蛋白可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，如ELISA方法等。5）本专利技术所表达的目的蛋白，可直接用于制备L7/L12蛋白单克隆抗体的抗原。附图说明图1是本专利技术实施例的树突状细胞培养图。图2是本专利技术流式细胞仪检测树突状细胞的表型结果。图3是本专利技术得到的多肽作用树突状细胞后IL-2的分泌量；样本依次为1-5：多肽，与实施方法中列出的多肽顺序相对应，6：已知抗原表位对照；7：阴性对照。图4是本专利技术得到的的多肽作用树突状细胞后IL-4分泌量；样本依次为1-5：多肽，6：已知抗原表位对照；7：阴性对照。图5是本专利技术得到的多肽作用树突状细胞后IFN-γ分泌量；样本依次为1-5：多肽，6：已知抗原表位对照；7：阴性对照。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。一、实验材料的制备1）抗原表位多肽的获得用生物信息学软件对布鲁氏菌L7/L12蛋白氨基酸的组成、性质以及其高级结构进行分析，结合所有结果，挖掘获得可能具有免疫原性的五个多肽片段，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，得到各多肽序列如下：LAKIVEDLSALTVLEAAELSKLL（SEQ ID NO.2，在后述的内容中为多肽样本1）；GVSAAAPVAVAAAGGAAPAAA（SEQ ID NO.3，在后述的内容中为多肽样本2）；INVIKEVRALTGLGLKEAKDL（SEQ ID NO.4，在后述的内容中为多肽样本3）； EAKDLVEGAPKAVKEGASKDEAEKIKA（SEQ ID NO.5，在后述的内容中为多肽样本4）；KIKAQLEAAGAKVELK（SEQ ID NO.1，在后述的内容中为多肽样本5）。在下述的内容中多肽样本的次序按2）小鼠骨髓源树突状细胞（DC）的培养颈椎脱位法处死Babl/c小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10 min。弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5 min，弃上清。用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48～72小时。轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，得到富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)，经在显微镜下观察期形态符合骨髓源树突状细胞的特征，参见附图1；流式细胞仪检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1。

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1。2.一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽。3.一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹小安，周继章，李兆才，娄忠子，景志忠，付宝权，尚佑军，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62