本发明专利技术公开了一株粘质沙雷氏菌RZ 21‑C6及其应用，本发明专利技术所述粘质沙雷氏菌RZ21‑C6，保藏编号为CGMCCNo.12714。本发明专利技术突变菌株具有底物利用效率高、遗传稳定性高、灵菌红素产量高的优点，其对木糖的利用效果尤佳。在5L发酵罐中，以木糖为主要成分的农残秸秆水解液廉价生物质碳源被开发用于灵菌红素生产，多批次发酵时灵菌红素产量可达15‑20g/L，总还原糖直接被用于灵菌红素合成的转化率在20％以上。本发明专利技术提供的粘质沙雷氏菌常压室温等离子体诱变菌株生产灵菌红素的方法，以及该菌对木糖和农残秸秆水解液的利用可以推进灵菌红素产业化的实现，可以用于生物医药、生态环境治理和农业生防等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一株常压室温等离子体诱变后的粘质沙雷氏菌高效利用木糖或农残秸秆水解液高产灵菌红素的方法。
技术介绍
灵菌红素是一个天然红色素家族的总称，其基本结构是由三个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架，分子式为C20H25N3O，分子量为323.2Da。自1929年Amako等在研究沙雷氏菌生长时发现并由Harashima等在1960年首次分离获得以来，对该物质性质及生物活性的研究一直备受关注。除了作为一种天然的生物染料之外，它的许多生物学活性也被逐渐人们所认识，包括抗细菌、抗疟疾、抗真菌和抗原生动物的活性。大量报道还表明其在水体富营养化的水污染治理和农业生防上也有应用价值。随着近几年对细胞凋亡的研究发现，灵菌红素能引起癌细胞的凋亡而对正常细胞的毒性却很小，是一种良好的抗癌药物。美国国立癌症研究所更是发现合适浓度的灵菌红素对人的57种不同肿瘤细胞具有明显抗性作用。灵菌红素作为一种次级代谢物，其生产主要是通过微生物合成的。自然界中产灵菌红素的菌株主要包括粘质沙雷氏菌、放线菌、假单胞菌，以及近年来发现的某些特殊的海洋细菌等。其中以对粘质沙雷氏菌的研究最为广泛。灵菌红素产物在粘质沙雷氏菌的生物合成中是通过两个双歧途径完成的，前体物是一个单吡咯前体2-甲基-3-戊基吡咯和一个双吡咯前体4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧基乙醛，经过缩合酶缩合偶联形成线性的三吡咯化合物灵菌红素。灵菌红素的合成是由pig基因簇完成的，该基因簇包括16个基因，其中14个基因直接负责灵菌红素及其前体的合成，另外两个基因负责调控这一生物合成过程。这表明灵菌红素的合成是一个多基因控制，受到多因素影响的复杂生物过程。目前微生物发酵法生产灵菌红素的产量千差万别，文献报道中产量大多不高于1g/L，只有少数突破10g/L的产量。这主要是由于粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的条件影响极为复杂。造成灵菌红素产量差异很大的原因主要来自菌株差异、碳氮源等培养基底物成分、温度、pH值、通气量等。而其中不同的底物和生产菌株本身的差异对色素成分及产量影响最大。尤其是依赖于菌株自身的特性的粘质沙雷氏菌对低值碳源的利用和灵菌红素的高效合成方面仍有极大的提升空间。值得一提的是目前尚没有对木糖做底物合成灵菌红素的相关报道，而木糖主要是作为大自然界最丰富的木质纤维素生物质主要成分木聚糖的单体，开发能够高效利用以木糖为主要成分的木质纤维素生物质水解液的遗传稳定的工业生产菌株已经成为可再生化学品
和能源生物炼制领域的研究热点。微生物的诱变育种因具有研究条件和技术要求不高、简便快捷、效果显著的特点，成为实验室和企业最常用的方法之一。对粘质沙雷氏菌进行诱变育种以提高灵菌红素的产量也有报道，如氯化锂和甲磺酸乙酯处理，紫外诱变和微波诱变等，但效果有限。而常压室温等离子体由于自身温度低、活性粒子浓度高、种类多样且作用于微生物能够改变其通透性同时引起基因损伤，从而有望导致微生物基因序列及其代谢网络的变化，引发微生物在较大几率上发生有益于生产的正突变。本专利技术利用本实验室筛选的一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌为出发菌株，前期通过发酵优化后灵菌红素产量为2.64g/L，仍然存在产量偏低、菌株易退化，遗传稳定性较差等缺陷。本专利技术拟通过常压室温等离子体进行诱变育种，期望解决上述菌株遗传稳定性较差，灵菌红素产量不高，对廉价生物质碳源利用不足的问题，尤其是缺乏对含有木糖的大量农残物秸秆水解液的利用能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714，以及使用该菌株高效生产灵菌红素的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：一株高产灵菌红素的突变菌株，名称为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21-C6，保藏编号为CGMCCNo.12714。所述菌株的获得包括如下步骤：(1)将经过摇床培养的粘质沙雷氏菌原始菌株的发酵液用生理盐水稀释到106-107个/mL，取10μL涂布在ARTP诱变仪器金属载体上，参数设置为：气流量10-15L/min，电源功率80-120W，处理时间为15-240s。诱变结束后，用无菌镊子将金属片放到装有1mL生理盐水的离心管中。在振荡器上震荡1-2min，把附着在金属载片上的微生物洗脱下来形成菌悬液。(2)将所得到的菌悬液进行合适的梯度稀释，取0.1mL稀释液涂布到含有发酵液培养基的平板上，28-32℃培养箱培养24-48h，做致死率曲线。(3)选取致死率在95％以上处理时间的红色优于原始菌株的单菌落接种到含有木糖的96孔平板上避光培养，24-48h后检测其生物量和色素量，筛选出色素产量和生物量显著高于其他的菌株。(4)所获得最佳菌株连续发酵培养10代以上以鉴定其稳定性，获得的稳定高产突变菌株为粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714。本专利技术突变菌株利用木糖或者农残秸秆水解液发酵生产灵菌红素的方法包括如下步骤：(1)接种2-3环粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714至30mL的一级种子培养基中，该培养基配
方为酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH为7.0，28-32℃、摇瓶转速150-300rpm培养12-24h至OD600＝1.0。(2)取上述一级种子液，按3％-5％的接种量接种至30mL二级种子培养基，该培养基配方为木糖20g/L以内，蛋白胨25g/L，FeSO4·7H2O 0.23mM和CaCl2 16.68mM，利用CaCO3控制pH在6.0-8.5，3％-5％接种量，在28-32℃条件150-300rpm避光摇瓶培养24-48h；(3)接种3％-5％的二级种子培养液在5L发酵罐里发酵产灵菌红素，装液量3L，初始碳源为木糖或者农残秸秆水解液总还原糖浓度20g/L以内，蛋白胨25g/L，FeSO4·7H2O 0.23mM和CaCl2 16.68mM，培养基中农残秸秆水解液总还原糖初始浓度消耗至5g/L以下时，单次直接补充浓缩农残秸秆水解液至总还原糖浓度为原初始浓度，补料次数不限，发酵温度为28-32℃，利用HCl和NaOH控制pH在6.0-8.5，溶氧40-60％，转速为300-400rpm，避光发酵150-200h。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)通过ARTP诱变育种，获得一株性状优良，遗传稳定性高，高产灵菌红素的粘质沙雷氏突变菌株。(2)本专利技术获得的粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714不仅能够高效利用传统的蔗糖等碳源，而且还能利用木糖及其与其他单糖的混合组分发酵生产灵菌红素。(3)以玉米秸秆水解液为代表的廉价农残秸秆生物质首次被开发用于灵菌红素的生产，经发酵补料策略优化，灵菌红素浓度可达15-20g/L。附图说明图1为粘质沙雷氏菌ARTP诱变的致死率曲线。图2为19株正突变菌株菌体生长与色素合成的比较。图3为灵菌红素的紫外可见吸收光谱。图4为灵菌红素的高分辨率质谱图(FT-ICR-MS)。图5为突变菌的菌体生长和色素合成的遗传稳定性分析。图6为原始菌株与突变菌株的TEM显微观察。图7为原始菌株和突变菌株的细胞膜渗透性分析(A图为外膜，B图为内膜)。图8为模拟混糖发酵生产灵菌红素的过程曲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21‑C6，保藏编号为CGMCCNo.12714。
【技术特征摘要】
1.一种粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)RZ 21-C6，保藏编号为CGMCCNo.12714。2.权利要求1所述粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714在生产灵菌红素中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是以木糖或者农残秸秆水解液为碳源。4.一种利用权利要求1所述粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714生产灵菌红素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)粘质沙雷氏菌CGMCCNo.12714的一级种子培养基为酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，装液量30mL，在28-32℃条件150-300rpm摇瓶培养12-24h至OD600＝1.0；(2)二级种子培养基为木糖20g/L以内，蛋白胨25g/L，FeSO4·...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈飞，戴传超，杨晶，杨启银，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。