一种酶法制备(S)-环氧苯乙烷的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备(S)‑环氧苯乙烷的方法，属于生物催化技术领域。本发明专利技术在正己醇/缓冲液的双相体系中，利用来源于宇佐美曲霉的环氧化物水解酶催化外消旋环氧苯乙烷的水解动力学拆分，制备(S)‑环氧苯乙烷的方法；与单相反应体系相比，动力学拆分rac‑SO的浓度从24g/L提高至120g/L；时空产率从为3.1g/L/h提高至20.3g/L/h；动力学拆分120g/Lrac‑SO制备(S)‑SO的ee值从36.8％提高至98.3％，并实现了(S)‑SO的克级制备。本发明专利技术方法工艺简单、产物的对映体纯度和得率高、催化效率高和环境友好，具有较大工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶法制备(S)-环氧苯乙烷的方法，属于生物催化

技术介绍
手性环氧化物和邻二醇是一类高附加值的多功能合成子或砌块，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成，如白三烯、昆虫信息素、甾类物质、β-肾上腺素阻断剂、神经保护剂和艾滋病毒蛋白酶抑制剂等。传统的化学法合成具有光学活性的环氧化合物和邻位二醇时，往往需要重金属类有毒物质作为催化剂且反应条件较为苛刻，不仅面临着环境的巨大挑战，且难以得到高对映体纯度的目的产物，生产效率低。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)可催化水解酶动力学拆分(Hydrolytic kinetic resolution)外消旋环氧化物制备手性环氧化物或邻二醇，具有产物对映体纯度和产率高以及对环境友好等优点而备受关注。微生物来源的EHs不需要辅助因子、立体选择性强、底物谱宽广、绿色无污染和反应条件温和等特点，成为一种非常具有潜力的酶催化剂。利用微生物来源的EHs生物法制备手性环氧化物与二醇的合成路线为人们提供了一种可能取代化学方法的高效专一、环境友好的合成方法。然而，底物和产物为水不溶性有机化合物，且底物在水相中易自发水解，均不利于EHs的催化反应。另外，酶催化反应存在底物或者产物抑制作用、稳定性差等不利因素，也使工艺规模难以放大，极大的限制了它们在工业生产中的应用。目前，为解决EHs应用过程中遇到限制因素，酶固定化、非水相催化介质(水不溶性有机溶剂或离子液体)、和膜反应器等技术被引入酶促反应系统。Jia等利用DEAE纤维素对Bacillus megaterium的EHs进行了固定化，提高酶稳定性，固定化酶可循环使用10次，但酶固定化存在传质限制导致催化效率低。Archelas等使用A.niger EH拆分三氟甲基取代芳香族环氧化物，采用20％正辛烷/水两相反应体系，底物浓度为由10g/L提高到360g/L，但是不同来源的EHs有机溶剂稳定性等存在很大差异，如来源于Sphingomonas sp.的EH在正己烷中稳定，但来源于Rhodotorulasp.在正己烷中失去催化活性。Choi等将Rhodococcus glutinis EHs制成中空纤维膜反应器应用于两相拆分体系，降低了有机溶剂与底物对酶的失活作用，同时产物的及时移除解决了产物抑制问题，但膜反应器价格昂贵易耗损，不宜应用于实际工业生产应用中。因此，根据不同来源的EHs构建合适的生物催化体系，提高EHs的对映体选择性、稳定性及生产效率等是促进EHs的大规模生产及应用的关键。利用来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的重组环氧化物水解酶(reAuEH2)催化外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)具有高对映选择性、高催化活性和底物耐受性，但存在明显底物抑制作用，从而导致reAuEH2不能实现高浓度底物的有效拆分，且时空产率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用环氧化物水解酶(reAuEH2)高效制备(S)-环氧苯乙烷的方法。所述方法是构建有机/水双相体系，所述有机相可以是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、环己烷、正庚烷和正辛烷中的一种或几种的混合；所述水相可以是水、磷酸盐缓冲液和Tris-盐酸缓冲溶液等，其pH为6.0～9.5；有机相与水相的体积比是1:9至9:1；反应体系中底物与环氧化物水解酶的用量的质量比例是30～1(w/w)，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反应温度0～35℃，搅拌条件下进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶的基因来源于宇佐美曲霉，环氧化物水解酶为大肠杆菌表达重组酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述有机相为正己醇。在本专利技术的一种实施方式中，所述水相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，有机相为正己醇，水相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的体积比1:1。在本专利技术的一种实施方式中，底物与酶的用量比例为6:1(w/w)。在本专利技术的一种实施方式中，底物浓度120g/L，底物与酶的用量比例为6:1(w/w)。在本专利技术的一种实施方式中，反应温度为25℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶的制备是收集产环氧化物水解酶的重组菌全细胞湿菌体，洗涤悬浮，超声破碎后离心收集上清液，过滤得到酶液。酶液可进一步冻干得到冻干酶粉。在本专利技术的一种实施方式中，还可以用产环氧化物水解酶的重组菌全细胞替代酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述产环氧化物水解酶的重组菌全细胞的制备是收集产环氧化物水解酶的全细胞湿菌体，或全细胞冻菌体。在本专利技术的一种实施方式中，产环氧化物水解酶的全细胞可以是产来源于宇佐美曲霉的环氧化物水解酶的大肠杆菌基因工程菌。本专利技术以rac-SO为底物，E.coli/(reAuEH2)全细胞或reAuEH2酶作为生物催化剂，在合适的双相体系中实现rac-SO的克级规模的动力学拆分制备手性纯的(S)-SO。本专利技术显著提高了水解动力学拆分的rac-SO的浓度、时空产率和产物(S)-SO的对映体纯度。与单水相反应体系相比，reAuEH2催化rac-SO的浓度从24g/L提高至120g/L，提高5倍；时空产率从为3.1g/L/h提高至20.3g/L/h，提高6.5倍；催化120g/L rac-SO制备(S)-SO的ee值从36.8％提高至98.3％。本专利技术实现了(S)-SO的克级制备，且工艺简单、产物的对映体纯度和得率高、催化效率高和环境友好，具有较大工业化应用前景。附图说明图1 ReAuEH2催化外消旋环氧苯乙烷水解动力学拆分的时间进程曲线具体实施方式实施例1环氧化水解酶酶活力测定方法：在1.5mL的EP管中加入100μL酶液和850μL磷酸钾缓冲液(50mM，pH＝7.0)，35℃预热2min；加入50μL 200mM的rac-SO，反应15min后，加入1mL乙酸乙酯中混匀，10000r/min离心5min后，取上层有机相于新的EP管中，加入适量无水MgSO4干燥过0.22μm的有机膜，进行手性气相色谱分析。色谱条件：岛津GC-2010GC气相色谱仪，CYCLOSIL-B手性色谱柱，火焰离子化检测器；进样口和检测口温度为250℃,从100℃以5℃/min程序升温至190℃；(R)-SO和(S)-SO保留时间为6.087和6.187。酶活力单位定义：在此测定条件下，以每分钟消耗1μmol环氧苯乙烷所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶活力单位(U)。(S)-SO的ee＝[(S-R)/(S+R)]×100％。实施例2重组环氧化物水解酶(reAuEH2)的制备：AuEH2的核酸序列和氨基酸序列及表达重组酶reAuEH2的工程菌E.coli/(reAuEH2)的构建参见公开号为CN102994470A的专利技术专利申请，挑取E.coli/(reAuEH2)单菌落于LB培养基中37℃条件下培养12h，以2％(v/v)的接种量转接入新鲜的100mL的LB培养基中，37℃条件下培养2h后，加入0.2mM IPTG诱导剂28℃培养8h，诱导reAuEH2的高效表达，重组细胞经8000rpm离心收集，加入磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)悬浮，超声破碎后离心收集上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备(S)‑环氧苯乙烷的方法，其特征在于，构建有机/水双相体系，所述有机相是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、环己烷、正庚烷和正辛烷中的一种或几种的混合；所述水相是水或缓冲液溶液，其pH为6.0～9.5；有机相与水相的体积比是1:9至9:1；反应体系中底物与环氧化物水解酶的质量比例是30～1，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反应温度0～35℃。

【技术特征摘要】
1.一种制备(S)-环氧苯乙烷的方法，其特征在于，构建有机/水双相体系，所述有机相是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、环己烷、正庚烷和正辛烷中的一种或几种的混合；所述水相是水或缓冲液溶液，其pH为6.0～9.5；有机相与水相的体积比是1:9至9:1；反应体系中底物与环氧化物水解酶的质量比例是30～1，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反应温度0～35℃。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环氧化物水解酶的基因来源于宇佐美曲霉。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，有机相为正己醇，水相为pH 7.0的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，胡蝶，王瑞，叶慧华，唐诗涵，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32