一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16、S119、S83，本发明专利技术同时公开一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的方法。本发明专利技术的方法可将‘夏翠芥蓝’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子检测领域，尤其涉及一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法。
技术介绍
种子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优劣程度直接影响农产品的质量和产量。品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但从遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定是实质上是对品质基因型的鉴定，只有通过鉴定DNA分子本身才能准确可靠的鉴定品种的基因型。DNA分子标记技术是随着分子生物学的发展而发展起来的一种新型的鉴定方法。它具有简便、快速、准确的特点。目前常用的分子标记技术包括AFLP，SRAP，SCAR，SSR等，SSR分子标记分布广泛，且具有共显性和高多态性等特征。加之甘蓝(芥蓝为甘蓝的一个变种)已经完成基因组测序，有足够的SSR标记可以选择。芥蓝是起源于华南地区的一种特色叶菜，为甘蓝的一个变种。有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现，使得品种间尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之夏翠芥蓝是利用自交不亲和系配制而成的杂交一代，在制种过程中母本有一定的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失。“夏翠芥蓝”是以Lb07F为母本，Lb07M为父本育成的国内首次通过品种审定的杂交种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的早熟品种。为了保证优良品种产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法，旨在解决目前在夏翠芥蓝的杂交一代，在制种过程中母本的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失的问题。本专利技术是这样实现的，一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16、S119、S83；所述BOE16引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1序列为BoE16-F:5’-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3’，SEQ ID NO:2为BoE16-R:5’-CAAACGTGGAAGGAGATTA。进一步，SSR引物还采用S119引物，所述S119引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:3序列为S119-F:5’-TTGCACACATACCAGATGCC-3’,SEQ ID NO:4序列为S119-R:5’-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC。进一步，SSR引物还采用S83引物，所述S83引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5序列为S83-F:5’-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3’，SEQ ID NO:6序列为S83-R:5’-GAGCCAAGAAAGGACCTAAGAT。本专利技术另一目的在于提供一种夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定方法，该夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法包括如下步骤：1)提取芥蓝幼苗基因组DNA；2)以芥蓝基因组DNA为模板，使用SSR引物BOE16、S119、S83进行PCR扩增；3)对扩增的产物进行凝胶电泳；4)对电泳结果进行分析，同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少亲本特异性条带中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，计算方法为：SSR鉴定杂交种比率(％)＝(杂交种带数/总带数)×100％，其中，SSR引物BOE16产生458bp的母本特异标记和产生485bp的父本特异标记。提取芥蓝幼苗基因组DNA包括以下步骤：①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μl 2％CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min，每隔5min摇动一次；②静置至室温后在4℃下12000rpm离心10min，将上清(约800μl)转移到新的2ml离心管；③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中；④加2/3体积340μl预冷的异丙醇，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于－20℃下培养30min；⑤在4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μl预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀两次，微干；⑥加入100μl无菌水溶解。进一步，PCR扩增的20μl反应体系为：基因组DNA 5ng，Mg2+0.15mmol·L-1，dNTP 0.2mmol·L-1，SSR引物0.25mmol·L-1，Taq酶0.2U。进一步，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。进一步，所述凝胶电泳为扩增产物在双垂直非变性浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1％AgNO3银染15min；银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.04％Na2CO3显色，显色后在灯箱上拍照分析。本专利技术的方法可将‘夏翠芥蓝’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，现在鉴定纯度的方法是将杂交种子种植在田间，苗长大后肉眼进行观察哪些是杂交种，哪些是假杂种，这种方法时间长，占地
大，还要非常有经验的一线工作人员才能鉴定出，准确率因人而异，而利用SSR引物进行鉴定可以达到快速、准确、有效的特点，节省人力、物力、财力；本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。附图说明图1是本专利技术实施例提供的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定方法流程图；图2是本专利技术实施例提供的引物BOE16夏翠芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱一；图3是本专利技术实施例提供的引物BOE16夏翠芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱二；图中；P1：母本A-2；P2：父本C-8：F1为杂交一代种子。图4是本专利技术实施例提供的引物S119夏盛芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱一；图5是本专利技术实施例提供的引物S119夏盛芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱二；图中：P1：母本A-2；P2：父本C-8：F1为杂交一代种子。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图及实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16、S119、S83；所述BOE16引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1序列为BoE16-F:5’-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3’，SEQ ID NO:2为BoE16-R:
5’-CAAACGTGGAAGGAGATTA；所述S119引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16；所述BOE16序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1序列为BOE16‑F:5’‑CGTAAGCGAGATAGGCAGAT‑3’，SEQ ID NO:2序列为BOE16‑R:5’‑CAAACGTGGAAGGAGATTA。

【技术特征摘要】
1.一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16；所述BOE16序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1序列为BOE16-F:5’-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3’，SEQ ID NO:2序列为BOE16-R:5’-CAAACGTGGAAGGAGATTA。2.如权利要求1所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，所述SSR引物还采用S119，所述S119序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:3序列为S119-F:5’-TTGCACACATACCAGATGCC-3’,SEQ ID NO:4序列为S119-R:5’-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC。3.如权利要求1所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，所述SSR引物还采用S83，所述S83序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5序列为S83-F:5’-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3’，SEQ ID NO:6序列为S83-R:5’-GAGCCAAGAAAGGACCTAAGAT。4.一种利用权利要求1所述引物进行夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，该夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法包括如下步骤：1)提取芥蓝幼苗基因组DNA；2)以芥蓝基因组DNA为模板，使用SSR引物BOE16进行PCR扩增；3)对扩增的产物进行凝胶电泳；4)对电泳结果进行分析，同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少亲本特异性条带中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物BOE16产生458bp的母本特异标记和产生...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂花，陈汉才，王亭亭，黎庭耀，张艳，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44