本发明专利技术涉及将可以存在于聚糖部分上的唾液酸衍生化的方法。这种方法可以用于确定例如糖蛋白和糖脂的糖基化分布，以及这种方法在临床分析以及生物发育和控制中的应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及衍生化可以存在于聚糖部分之上的唾液酸的方法。这可以用于确定例如糖蛋白和糖脂的糖基化分布(glycosylation profile)，以及这种方法在临床分析以及生物发育和控制中的应用。专利技术背景糖基化是对如溶解度、折叠和受体结合活性[1-3]的蛋白特性具有显著影响的常规翻译后修饰。越来越多的疾病已经表现出与糖基化的改变相关，包括各种形式的癌症、自身免疫和先天性疾病[4-8]。正因为如此，单个蛋白质或如血浆的更复杂样品的聚糖分析可以作为重要的临床生物标志物[9]。此外，已知聚糖影响生物药物的活性、稳定性和免疫原性，需要仔细地监测和控制[10，11]。糖基化的一个重要特征是唾液酸(例如，N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸)的存在[12]。这些单糖已显示在细胞通信中具有作用，与特定类型的凝集素相互作用，并已与癌症和亚稳态(metastaticity)相关联[13-15]。在人的糖基化的情况下，唾液酸可以通过α2,6或α2,3糖苷键连接于末端半乳糖，并因此显示不同的功能。例如，α2,3连接的N-乙酰神经氨酸是用于形成唾液酸基路易斯X结构而特别需要的，其已显示可以指示几种类型癌症的转移[16-19]，而α2,6连接的唾液酸在半乳糖凝集素抑制中显示作用，从而促进细胞存活[20-22]。随着分析需求的增加，发展高通量(HTP)糖组学方法引起了人们极大的兴趣。一种良好适于糖组学研究的技术是基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法(MS)，因为它可以迅速地提供聚糖结构的组成、序列和支化方面的信息[23]。然而，唾液酸是通过相对较弱的键连接于聚糖
的，在质谱仪中各离子化和加速阶段期间通过在源和亚稳衰变常常导致残基的损失。另外，唾液酸化聚糖物质在添加盐的情况下倾向于显示高变异性，导致单个聚糖组合物有多个信号。此外，如存在于唾液酸上的羧基相当易于通过MALDI负电离，在比较酸性和中性寡糖时产生信号强度的偏差，阻碍对混合样品的相对定量[24]。改善唾液酸化聚糖的MALDI-TOF-MS测定的一种方法是衍生化[25，26]。具体地，唾液酸羧基的化学修饰可以很大程度上防止亚稳衰变，并且所得到的反应产物可以连同非唾液酸化物质一起在正离子模式MALDI-TOF-MS中进行分析[24，25，27]。有趣的是，已经开发出反应条件允许以连接依赖的方式进行唾液酸衍生，从而对α2,3键连接的唾液酸(易于内酯形成)和α2,6键连接的唾液酸(经历其他化学修饰，如酯化和酰胺化)进行差异化衍生化。在文献中描述的方法涉及甲酯化或(甲基)酰胺化，但这些通常需要高度纯化的聚糖样品，严酷的条件或长的反应时间，并且不显示完全的连接特异性[28-30]。虽然这些程序可以为唾液酸化寡糖的分析提供信息，但是对于复杂样品HTP分析的适用性有限。本专利技术的目的之一是避免和/或减轻上述缺点中的至少一个。专利技术概述本专利技术基于本专利技术人进行的研究，以开发适于与唾液酸化聚糖的MALDI-TOF-MS测定一起使用的唾液酸衍生化方法。本专利技术的第一个方面提供了一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，该方法包括：将生物样品或聚糖制剂与包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma Pure)的试剂反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。本专利技术人已观察到，衍生化是以唾液酸残基的连接特异的烷基酯化和内酯形成的方式进行的，几乎没有或没有观察到酰胺化。通常，可以观察到少于1％的酰胺化，如少于0.5％或0.1％的酰胺化。本专利技术人已观察到，
唾液酸乙酰化可以在选择的衍生条件下被保留。另外，衍生化可以对于N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸发生，还可以对于连接于如N-乙酰氨基葡糖的N-乙酰氨基己糖残基的唾液酸发生。本专利技术可以使存在于聚糖部分上的衍生的唾液酸残基，以在本领域中已知的如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)的质谱技术被分析，如本文中将进一步描述的。然而，衍生反应可以允许其他类型的分析得以进行。例如衍生反应可以允许糖缀合物和/或其它糖基化分子被修饰从而修改其物理化学性质，包括改变在毛细管凝胶电泳中的迁移位置，或者在色谱结合分析中的释放。所述至少一种碳二亚胺可以是N,N'-二环己基碳二亚胺(DDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，例如以其盐酸盐的形式。所述至少一种碳二亚胺可以以0.01-1M，如0.1-0.8M，通常，0.25-0.75M的浓度在溶液中提供。合适的三唑包括羟基苯并三唑(HOBt)，通常以水合的形式，诸如一水合物，其可以以0.1-1M，如0.2-0.8M，通常，0.25-0.75M的浓度在溶液中提供。所述试剂可以包括单个碳二亚胺和三唑/Oxyma Pure组合，或可以提供包含一个或多个碳二亚胺与一种或多种三唑/oxyma pure组合的混合物。试剂成分的特别优选的组合是DCC与HOBt，DCC与oxyma pure，EDC与HOBt以及EDC与oxyma pure。特别优选的组合是EDC和HOBt。通常，试剂组分作为单一试剂组合物提供。试剂组分可以以醇溶液提供，如甲醇、乙醇、(异)丙醇或丁醇。试剂的醇溶液可以是0.01至1M，如0.05至0.8M，0.2至0.7M，如0.4至0.6M，特别是0.5M。备选地，试剂最初可以以冻干形式提供，其用样品和合适的醇恢复(reconstitute)。通常，用于唾液酸衍生反应的醇含量将为50％至99％，例如70％至96％，特别是95％v/v。本专利技术人已观察到，醇的选择可以影响所发生衍生化的程度和类型。在某些实施方案中，优选的醇为甲醇或乙醇，并且在一个特别优选的实施方案中，醇是乙醇。反应可优选在酸性或中性条件(例如，pH值1.9至pH 7.6)下进行。这
可以通过加入酸来实现。如三氟乙酸(TFA)，如0.1％至0.4％的TFA。本专利技术人已观察到，在酸性条件可以减少或最小化不需要的副产物。事实上，本专利技术人已观察到，使用酸性条件可以有助于使利用先前已知的衍生化剂4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)所观察到的副产物最小化，特别是使用不纯的样品时。本专利技术的另一个方面提供了衍生化在聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，该方法包括：将生物样品或聚糖制剂与DMT-MM在酸性条件下反应；以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。优选的酸性条件是通过将TFA加入到反应中提供的，例如0.1％至0.4％TFA，通常为0.2％的TFA。本专利技术可以在纯化或不纯的样品上进行。例如，本专利技术人已经能够将来自血浆和纤维蛋白原样品的唾液酸化的聚糖衍生化，所述纤维蛋白原样品已经被酶消化的以使得任何聚糖都可用于反应。在释放N-连接寡糖中使用的合适的酶是糖苷内切酶，如PNGase F。有利的是，本专利技术人已经能够进行本专利技术的衍生化反应而不用按照上述酶反应所要求的任何纯化，这是与现有技术相反的，现有技术教导在可以进行衍生化之前需要从如血浆的生物样品纯化聚糖。不希望受理论的束缚，似乎其中提供试剂的醇溶液，可以能够沉淀蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，所述方法包括：将生物样品或聚糖制剂与包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2‑氰基‑2‑(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的试剂反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.21 GB 1320571.11.一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，所述方法包括：将生物样品或聚糖制剂与包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的试剂反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。2.根据权利要求1所述的方法，其中在衍生化之后，观察到少于1％的酰胺化。3.根据权利要求1所述的方法，其中唾液酸的乙酰化随衍生化被保留。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少的碳二亚胺是例如以其盐酸盐的形式的N,N′-二环己基碳二亚胺(DDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述三唑是羟基苯并三唑(HOBt)，通常以水合的形式，诸如一水合物。6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述试剂是混合物，诸如DCC与HOBt，DCC与oxyma pure，EDC与HOBt以及EDC与oxyma pure。7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述试剂在醇溶液，如甲醇、乙醇、(异)丙醇或丁醇中提供。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇是乙醇。9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法在酸性或中性
\t条件下进行。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法是在酸性条件下进行的，诸如通过加入三氟乙酸(TFA)，诸如0.1％至0.4％的TFA进行。11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法是对纯的或不纯的样品进行的。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述不纯的样品是生物样品，诸如已经经过酶消化的血浆、免疫球蛋白或纤维蛋白原样品。13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述聚糖部分在衍生化之前或之后被标记，诸如用放射性或非放射性标记同位素、或者荧光或发光标签标记。14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述衍生化的和任选地标记的唾液酸化聚糖在衍生化和/或标记之后被纯化，诸如通过亲水性相互作用色谱(HILIC)，例如棉绒，多孔石墨化碳固相萃取(PGC-SPE)，阳离子交换树脂，液-液萃取或前述方法的混合...
【专利技术属性】
技术研发人员：德尼斯·布兰克，曼弗雷德·伍尔，卡利·罗伯特·雷丁，
申请(专利权)人：莱顿教学医院，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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