一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。本发明专利技术中利用维生素C促进脂肪干细胞膜片形成，然后利用反复冻融法联合Triton×100脱细胞处理，构建一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。该材料表面平整，质地均一，细胞外基质含量丰富，形成孔隙样三维组织，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，无免疫原性，能自体移植，具有临床应用的可操作性。且其制备方法简单，十分具有实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法。
技术介绍
肿瘤手术、外伤或先天缺陷均可造成严重软组织缺损，临床常用修复方法包括人工材料填充和自体组织瓣移植，但这些方法存在组织相容性差、创伤大、移植物坏死吸收等局限性。随着组织工程技术的发展，组织工程有望成为一种新型且有效的修复方法。细胞支架是组织工程的主要研究内容之一，起到支撑种子细胞和引导组织再生的作用。理想的支架材料应具有无免疫原性、可塑性强以及良好的生物相容性，迄今仍未找到一种理想细胞支架材料用于组织工程。人工高分子材料虽具有足够的机械强度和适当的降解速度，但免疫原性强，缺乏天然的细胞外基质，细胞识别位点不足，细胞亲和力较弱，且具有一定生物毒性。脱细胞基质材料可以克服上述缺陷，脱细胞技术是指通过化学和物理的方法去除异体或异种组织器官中的细胞成分，细胞外基质在经过去除细胞和可溶性蛋白处理后，可以维持正常组织基质成分，形成一种由胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹力蛋白组成的三维支架结构。另外，脱细胞支架保留了完整的血管网络结构，易于营养物质及氧气的运输，三维的细胞外基质结构为细胞的贴附和增殖提供了一个合适的生物环境。目前的脱细胞基质材料来源主要为异种动物筋膜组织和器官，已有商品化生产脱细胞基质产品，如猪小肠黏膜脱细胞基质材料(SIS)。SIS是一种美国FDA批准的可生物降解的、无细胞的、异于胶原组织基质的移植物，取材于猪小肠黏膜脱细胞组织，已经用于疝、尿道狭窄等疾病临床治疗。然而，研究表明，异种来源脱细胞外基质成分移植后不仅在局部产生炎症反应，且仍具有一定的免疫原性，当异种脱细胞基质异体的胶原基质与宿主血液的接触可直接激活一系列免疫级联反应，
产生免疫排斥，影响手术效果，甚至可引起患者死亡。细胞膜片技术是上世纪90年代发展起来的一种组织工程新技术，该技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌，能完整的保留细胞外基质和细胞间连接，形成由一种由细胞和细胞外基质组成的致密膜片状组织。细胞膜片厚度与机械强度除了与培养基条件有关，还与细胞类型密切相关。当细胞活性和增殖能力越强，细胞膜片形成的速度和厚度明显提高。与成体细胞相比，干细胞活性和增殖能力明显更强。脂肪干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞，具有增殖能力强、来源广泛、取材方便、培养简单的特点，是一种常用组织工程种子细胞。目前常用的脱细胞方法包括渗透溶液法、去污剂法、酶消化法、细胞冻融法等，没有一种方法适用于所有脱细胞材料类型。理想的脱细胞方法要求既能完全去除供体细胞，降低免疫原性，又能保留天然胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分，以保持足够的机械强度。针对细胞膜片的构成特点，对细胞膜片脱细胞处理应谨慎选择，应避免细胞外基质成分破坏和降解。因此，区别于目前脱细胞基质材料来源，通过构建自体脂肪干细胞膜片，优化脱细胞方法，制备一种无免疫原性的脱细胞基质材料可用于机体软组织缺损修复和作为组织工程支架材料。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法。本专利技术第一方面提供了一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。本专利技术第二方面提供了一种上述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将脂肪干细胞高密度的接种于细胞培养皿中；步骤二：在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，得到细胞膜片；步骤三：将所述的细胞膜片反复冻融，并在脱细胞液中振荡后漂洗，得到漂洗后的脱细胞基质材料；步骤四：将所述的漂洗后的脱细胞基质材料冻干处理，封装后灭菌，得到所
述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。较佳地，所述的高密度为5×104个/cm2。较佳地，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素进行刺激为以100μg/ml维生素C强刺激3天，更换50μg/ml维生素C温和刺激18天。较佳地，所述的步骤三中反复冻融为在液氨和温水中反复冻融。较佳地，所述的脱细胞液为Triton X-100脱细胞液。较佳地，所述的步骤三中，采用PBS缓冲液进行漂洗。本专利技术中利用维生素C促进脂肪干细胞膜片形成，然后利用反复冻融法联合Triton×100脱细胞处理，构建一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。该材料表面平整，质地均一，细胞外基质含量丰富，形成孔隙样三维组织，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，无免疫原性，能自体移植，具有临床应用的可操作性。且制备方法简单，十分具有实用价值。附图说明图1A与图1B为脂肪干细胞及其表型鉴定图；图2A和图2B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料HE染色比较图；图3A和图3B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料扫描电镜比较图；图4A和图4B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料Ⅰ型胶原表达情况图；图5A和图5B为脂肪干细胞膜片和脱细胞基质材料纤连蛋白表达情况图；图6A和图6B为脱细胞基质材料与SIS分别移植皮下HE染色比较图。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施例对本专利技术作进一步地说明，以更好地理解本专利技术。1、脂肪干细胞原代培养比格犬，6-8个月，戊巴比妥全身麻醉后无菌切取腹股沟处10g脂肪组织，剔除肉眼可见筋膜及血管，0.25％氯霉素浸泡30分钟，PBS漂洗3遍，眼科剪尽量剪碎成肉沫状，加入0.1％Ⅰ型胶原酶在37℃中消化1h，100目滤网过滤，300g离心5min，加入干细胞培养基重悬后接种于100mm细胞培养皿中继续培养，每2-3天更换培养基。脂肪干细胞培养基组成：450ml低糖DMEM培养基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+100mg/ml硫酸链霉素，0.22μm滤网过滤除菌。如图1A所示，通过酶消化法和梯度贴壁原代培养脂肪干细胞，细胞呈现螺旋形梭形分布(×100)。2.脂肪干细胞纯度鉴定将原代培养脂肪干细胞传代至P2，流式细胞仪鉴定其干细胞纯度，选取CD45、CD90、CD105作为表面抗原标志，0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化后4％多聚甲醛固定15分钟，PBS清洗2遍，300g离心5min后加入250μl PBS重悬，分别加入2μl CD45-FITC抗犬抗体、1μl CD90-PE抗犬抗体、2μl CD105-FITC抗犬抗体，在4℃条件下避光孵育30分钟，PBS清洗2遍，上机检测。如图1B所示，流式细胞仪鉴定干细胞纯度，其中CD45阴性表达，CD90和CD105阳性表达，证实其干细胞属性。3.脂肪干细胞膜片制备将P2代脂肪干细胞以5×104个/cm2接种于60mm细胞培养皿，待细胞融合至90％以上时，更换细胞培养基A继续培养，3天后更换细胞培养基B连续培养18天，每2天更换细胞培养液，培养3周即可成制备脂肪干细胞膜片，可直接用镊子轻轻撕下，大小约5×5cm。细胞培养基A成分：450mL低糖DMEM培养基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+100mg/mL硫酸链霉素+100μg/mL维生素C+3.7g/L NaHCO3细胞培养基B成分：450mL低糖DMEM培养基+50mL胎牛血清+100U/mL青霉素+100mg/mL硫酸链霉素+50μg/mL维生素C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料，其特征在于，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。

【技术特征摘要】
1.一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料，其特征在于，所述的脱细胞基质材料为自体脂肪干细胞膜片。2.一种根据权利要求1所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将脂肪干细胞高密度的接种于细胞培养皿中；步骤二：在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，得到细胞膜片；步骤三：将所述的细胞膜片反复冻融，并在脱细胞液中振荡后漂洗，得到漂洗后的脱细胞基质材料；步骤四：将所述的漂洗后的脱细胞基质材料冻干处理，封装后灭菌，得到所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料。3.根据权利要求2所述的基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的高密度为5×1...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅强，周术奎，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31