从CHO细胞培养物中制备抗体用于偶联制造技术

本发明专利技术部分基于以下观察，即CHO细胞氧化酶，尤其是QSOX1可在看似严苛的抗体纯化过程中留存以随后降低抗体与药物的偶联效率。氧化酶是否在纯化过程中留存取决于采用哪些纯化技术，这可在抗体之间不同。已知CHO细胞氧化酶的污染是后续偶联的潜在问题，可针对任意抗体设计将CHO氧化酶消除或至少减少至可接受水平的合适的纯化方案。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年11月25日提交的美国临时申请号61/908,568的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。序列表名称为3100-00111PC-ST25.txt的11KB的序列表于2014年11月21日生成，其通过引用纳入本文。背景在数百次临床试验之后，迄今为止大约30种单克隆抗体已经被FDA批准用于治疗多种病症，包括癌症、自身免疫疾病和感染因子。更多抗体尚未被批准的一个原因是抗体单独提供的作用机制，如效应物功能或阻断受体-配体相互作用可能不够有力以具有充分的治疗效果。抗体-药物偶联物(ADC)提供了其它机制，尤其是向细胞内部递送与抗体偶联的毒性部分，从而杀死细胞或者抑制其增殖。现有2种ADC在售：布妥昔单抗和曲妥珠单抗。许多其它ADC处于研发的不同阶段。ADC的产生包括抗体表达和纯化，之后是通常通过接头将抗体化学偶联至药物。附图说明图1：氧化性杂质对载药量的影响。在所示时间处，样品被还原并偶联。偶联水平随着时间降低的趋势表明存在氧化性杂质。图2a-2c：SEC分离后组分中抗体制备物(批号DEVNKB-1)中的氧化活性(图2a)。用抗-ALR(肝再生的活化剂)和抗-QSOX1抗体染色的SEC组分的Western印迹(分别是图2b和2c)。图3a-c：抗体制备物(批号DEVNKB-1)在Poros蛋白A柱上的分级分离(图3a)；各组分中的氧化活性(图3b)；和显示汇集的组分3和4的蛋 白质内容物的SDS-PAGE凝胶图像(图3c)。箭头指示与70kDa QSOX1和76kDa QSOX2一致的分子量。定义分离的抗体或ADC对于生产或纯化过程中产生的干扰蛋白和其他污染物通常是至少50％w/w纯的，但不排除单克隆抗体与过量的药学上可接受的运载体或旨在促进其使用的其他载剂混合。有时，单克隆抗体或ADC对于生产或纯化过程中产生的干扰蛋白和污染物是至少60％、70％、80％、90％、95或99％w/w纯的。单克隆抗体单独或作为ADC的组分与其目标抗原的特异性结合指亲和力为至少106、107、108、109或1010M-1。特异性结合在幅度上可检测地高于与至少一个不相关靶标之间的非特异性结合并可与之区分。特异性结合可以是特定空间拟合(如锁和钥匙类型)或特定官能团之间键形成的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合并不必然表示单克隆抗体结合一个且仅结合一个靶标。基础抗体结构是亚基的四聚体。各四聚体由两对多肽链构成，各对有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包含约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。该可变区初始表达连接至可切割信号肽。不含信号肽的可变区有时称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是不含轻链信号肽的轻链可变区。各链的羧基端部分界定恒定区。重链恒定区主要负责效应物功能。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，并确定了抗体的同种型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。(通常参见，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)(Paul，W.编，第2版，纽约拉文出版社(Raven Press，N.Y.)，1989，第7章，通过引用全文纳入本文以用于所有目的)。各轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体的情况之外，这2个结合位点是相同的。 链均显示由三个高变区接合的相对保守框架区(FR)的相同通用结构，所述高变区也称为互补决定区或CDR。来自各对的两条链的CDR通过框架区比对，能结合特定表位。从N-端到C-端，重链和轻链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat，《免疫学感兴趣蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes of Health)(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature 342：878-883(1989)的定义一致。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中为不同重链之间或不同轻链之间相应的残基分配了相同的编号。术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。一般而言，抗体片段与衍生它们的完整抗体竞争以特异性结合靶标，包括分开的重链，轻链Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab)c、双抗体、Dab、纳米抗体和Fv。可通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离来产生片段。术语“抗体”也包括双抗体(同二聚体Fv片段)或小抗体(VL-VH-CH3)、双特异性抗体等。双特异性或双功能抗体是具有2个不同重链/轻链对和2个不同结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.，79：315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.，148：1547-53(1992))。术语“抗体”包括抗体本身(裸抗体)或与细胞毒性药物或细胞生长抑制性药物偶联的抗体。术语“表位”是指抗原上抗体与之结合的位点。表位能够由连续的氨基酸来形成或由于一个或多个蛋白三级折叠而并列的不连续的氨基酸来形成。当接触变性溶剂时，由连续氨基酸形成的表位通常保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含在独特空间构象中的至少3个或更常见的至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如X-射线晶体法和二维核磁共振。参见，例如《表位作图方案》，刊于《分子生物学方法》(Epitope Mapping Protocols，in Methods in Molecular Biology)，卷66，Glenn E.Morris编(1996)。可以在简单的免疫实验中鉴定识别相同表位或重叠的抗体，显示一种抗体与另一种抗体竞争结合目标抗原的能力。也可通过对与抗原结合的抗体进行X射线结晶以鉴定接触残基，从而定义抗体的表位。或者，如果抗原中导致一个 抗体的结合能力减弱或消失的所有氨基酸突变导致另一个抗体的结合能力减弱或消失，则说明这两个抗体拥有相同的表位。如果一些导致一个抗体的结合能力减弱或消失的氨基酸突变导致另一个抗体的结合能力减弱或消失，则说明这两个抗体拥有重叠的表位。可通过试验确定抗体之间的竞争，其中一个受测试的抗体抑制了参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见例如Junghans等，Cancer Res.50：1495，1990)。如果在竞争性结合试验中，过量的测试抗体(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制了参考抗体至少50％(优选75％、90％或99％)的结合，则说明测试抗体与参考抗体之间产生竞争。竞争试验鉴定到的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合同一表位的抗体和所结合的表位与参考抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括：(a)进行纯化方案中的至少一个纯化步骤，以从表达所述抗体的CHO细胞的培养物中获得至少部分纯化的抗体制备物；(b)测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶；(c)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则用不同的纯化步骤重复步骤(a)和(b)；(d)如果检测到步骤(b)的制备物中CHO细胞氧化酶以可接受水平存在或不存在，则对表达所述抗体的CHO细胞的同一培养物或第二培养物进行导致可接受水平的CHO细胞氧化酶或检测不到CHO细胞氧化酶的至少一个纯化步骤，以获得至少部分纯化的抗体制备物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.25 US 61/908,5681.一种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括：(a)进行纯化方案中的至少一个纯化步骤，以从表达所述抗体的CHO细胞的培养物中获得至少部分纯化的抗体制备物；(b)测试所述制备物是否存在CHO细胞氧化酶；(c)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则用不同的纯化步骤重复步骤(a)和(b)；(d)如果检测到步骤(b)的制备物中CHO细胞氧化酶以可接受水平存在或不存在，则对表达所述抗体的CHO细胞的同一培养物或第二培养物进行导致可接受水平的CHO细胞氧化酶或检测不到CHO细胞氧化酶的至少一个纯化步骤，以获得至少部分纯化的抗体制备物。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括步骤(e)将所述至少部分纯化的抗体通过一个或多个巯基基团与药物偶联，以产生偶联的抗体。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞氧化酶是QSOX1。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的第二培养物是在体积上比步骤(a)中的培养物大的培养物。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的第二培养物在体积上比步骤(a)中的培养物大至少1000倍。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在至少一年的一段时间中对所述抗体的不同培养物多次进行步骤(d)和(e)。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，导致可接受水平的酶或检测不到酶的纯化方案包括以下步骤中的至少一个：用150-500mM NaCl浓度的盐洗涤液洗涤蛋白A柱、使用深度过滤、用季铵离子柱进行阴离子交换，或苯基膜过滤。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括鉴定凝胶上65-75kDa的条带。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过Western印迹或银染来鉴定所述条带。10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试包括对QSOX1活性的功能性测试。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述功能性测试产生过氧化氢作为所述活性的指标。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活性被锌离子抑制，所述抑制被EDTA逆转。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体不是布妥昔单抗。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞毒性药物选自抗微管蛋白剂、DNA小沟结合物、DNA复制抑制剂、化疗敏化剂和吡咯并苯并二氮杂二聚体。15.一种确定从CHO细胞培养物中纯化抗体的方法的方法，所述方法包括：(a)进行纯化方法，以从表达所述抗体的CHO细胞的培养物中获得至少部分纯化的抗体制备物；(b)测试所述制备物是否存在CHO酶QSOX1；(c)如果检测到步骤(b)的制备物中存在不可接受水平的所述酶，则用不同的纯化方法重复步骤(a)和(b)；16.一种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括：通过纯化方法从CHO细胞的培养物中纯化抗体，所述纯化方法包括以下步骤中的至少一个：在25-100mM NaCl浓度下洗涤蛋白A柱、使用深度过滤、用季铵离子柱进行阴离子交换，或苯基膜过滤，其中所述抗体与培养物中的QSOX1酶分离；并且将纯化的抗体通过一个或多个巯基与细胞毒性药物偶联以产生所述偶联的抗体。17.一种产生偶联的抗体的方法，所述方法包括：(a)进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·海耶斯，K·比姆，D·迈耶，R·莱昂，J·瓦里尔道格拉斯，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US