OspA的突变片段以及其相关方法和用途技术

本发明专利技术涉及用于预防和治疗疏螺旋体感染的组合物和方法。具体地说，本发明专利技术涉及包含外表面蛋白A(OspA)的杂合C‑末端片段的多肽、编码所述多肽的核酸、特异性结合所述多肽的抗体、包含所述多肽和/或所述核酸和/或所述抗体的药物组合物(具体地适于用作药剂或者用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法中)、治疗或预防疏螺旋体感染的方法以及免疫受试者的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于预防和治疗疏螺旋体(Borrelia)感染的组合物和方法。具体地说，本专利技术涉及一种包含外表面蛋白A(OspA)的杂合C-末端片段的多肽、一种编码所述多肽的核酸、一种特异性结合所述多肽的抗体、一种包含所述多肽和/或所述核酸和/或所述抗体的药物组合物(具体地适于用作药剂或用于治疗或预防疏螺旋体感染的方法中)、一种治疗或预防疏螺旋体感染的方法以及一种免疫受试者的方法。专利技术背景在欧洲和北美，莱姆疏螺旋体病或莱姆病是最常报道的蜱传疾病。所述疾病是由感染虫媒传播的革兰氏阴性样螺旋体广义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi s.l.)引起，并且可涉及多种器官或组织，导致皮肤、心脏、肌肉骨骼和神经学病症。在大多数国家，莱姆疏螺旋体病不是应具报疾病；因此没有关于年发病率的准确数据可用。在美国，致病物为狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi s.s.)并且莱姆疏螺旋体病定位于东北部、大西洋中部和中北上部各州。在2010年，美国疾病控制与预防中心(CDC)报道了总计约30,000例莱姆疏螺旋体病。CDC在2013年更新的报告，将其他来源的诊断数据考虑在内，从而估计在美国每年新病例的实际数量更接近300,000(http：//www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.ht ml)。在欧洲，阿氏疏螺旋体(B.afzelii)和伽氏疏螺旋体(B.garinii)为莱姆疏螺旋体病的主要致病物，而且狭义伯氏疏螺旋体和巴伐利亚疏螺旋体(B.bavariensis)根据地理位置在较低程度上促成莱姆疏螺旋体病。莱姆疏螺旋体病的患病率在不同欧洲国家变化相当大，并且从西到东患病率总体逐渐增加。在多数欧洲国家，报道的莱姆疏螺旋体病病例数目自20世纪90年代早期开始逐渐增加(例如，捷克共和国、爱沙尼亚、立陶宛；参见Lyme borreliosis in Europe，2006年WHO报道)，并且病例的地理分布也有所扩大。疏螺旋体属于螺旋体科家族，所述螺旋体科家族细分为医学上重要的密螺旋体(Treponema)属、钩端螺旋体(Leptospira)属和疏螺旋体属。广义伯氏疏螺旋体为约10-20μm长和0.2-0.5μm宽的螺旋状、运动活泼的革兰氏阴性菌，它在微量需氧的条件下生长。螺旋体细胞壁由细胞质膜组成，所述细胞质膜由肽聚糖和若干鞭毛围绕并且接着由松散结合的外膜围绕。莱姆疏螺旋体病通常分阶段地发生，各阶段的特征为出现缓解和恶化的不同临床表现。阶段1，早期感染，由皮肤的局部感染组成；数天或数周后为阶段2，播散性感染；数月至数年后为阶段3，持续性感染。然而，感染为可变的；一些患者仅患有局部皮肤感染，而其他患者仅显示疾病后期表现，如关节炎。莱姆疏螺旋体病的不同临床症状也是由不同的广义伯氏疏螺旋物种感染引起。狭义伯氏疏螺旋体更经常地引起关节表现(关节炎)和心脏问题，阿氏疏螺旋体主要引起皮肤症状(游走性红斑EM和慢性萎缩性肢皮炎ACA)，而伽氏疏螺旋体牵涉大部分莱姆神经疏螺旋体病病例。局部感染-感染的阶段1的最常见症状为游走性红斑，这出现于70％-80％的受感染人群中。这种皮肤损害之后通常为流感样症状，如肌痛、关节痛、头疼和发热。这些非特异性症状出现于50％的患有游走性红斑的患者中。播散性感染-在阶段2期间，细菌从感染部位移动到血流中，到达远端组织和器官。在此阶段出现的神经学、心血管和关节炎症状包括脑膜炎、颅神经病变和间歇性发炎性关节炎。持续性感染-感染的阶段3为慢性的并且发生于蜱叮咬之后数月至数年间。在北美最常见的症状为由狭义伯氏疏螺旋体感染所引起的风湿性关节炎。伽氏疏螺旋体引起的中枢神经系统的持续性感染在阶段3期间导致更严重的神经学症状，并且阿氏疏螺旋体引起的皮肤的持续性感染导致慢性萎缩性肢皮炎。在一些危险群体如农民、林业工人、徒步旅行者、跑步者或度假者中，正如在15岁以下的儿童和39岁与59岁之间的成人中一样，血清阳性率和疾病发病率增加，其中没有性别偏好。莱姆疏螺旋体病的这种增加的发病率与森林栖息地以及社会因素的改变有关。环境改变如森林片断化已导致啮齿动物捕食者如狐狸和猛禽类急剧减少，这进而导致老鼠数量增加，之后导致蜱数量增加。最近，不均衡的重新造林已增加鹿的数量并因此增加蜱的数量。郊区扩张和用于娱乐如露营和徒步旅行的林地区域使用的增加使人们与更大数目的疏螺旋体属蜱载体更深入地接触。所有这些因素共同导致疏螺旋体的更广泛分布和莱姆疏螺旋体病的更高发病率。抗微生物剂为治疗疏螺旋体感染的基本方法。所使用的抗生素取决于疾病的阶段、症状和患者对药物的过敏性。抗生素疗程的长度也取决于疾病的阶段和症状的严重性。早期莱姆疏螺旋体病通常用口服四环素如多西环素和半合成青霉素如阿莫西林或青霉素V来治疗。关节炎和神经学病症用高剂量静脉内青霉素G或头孢曲松治疗。高至30％的莱姆疏螺旋体病患者不展示疏螺旋体感染的早期特征症状，这使得诊断和治疗均成问题。抗生素疗程可为较长的(长至数月)并且有时为无效的，并且因此在疏螺旋体领域，特别是在晚期疾病期间很有争议。即使在有效治疗疏螺旋体的情况下，患者也可在数年过后患有衰弱疲劳、疼痛或神经症状，这些称为治疗后莱姆病症状。通常，抗生素的使用可产生不希望的后果，如靶微生物发展出抗性。最终，抗生素疗法可有效地治愈莱姆疏螺旋体病，但没有对之后的感染提供保护。单价血清型1-OspA-基疫苗(LYMErixTM)在美国得到批准并且在市场上销售，用于预防由狭义伯氏疏螺旋体引起的莱姆病，但所述疫苗是不再可用。此外，在欧洲和其他地方的不同血清型中的OspA序列的异质性妨碍了利用来自仅一种血清型的基于OspA的疫苗进行有效保护。包含来自一种OspA血清型的近端部分连同来自另一种OspA血清型的远端部分的嵌合OspA分子在保留这两种亲本多肽的抗原特征的同时，可用于预防和治疗莱姆病或莱姆疏螺旋体病(WO2011/143617，WO2011/143623)。目前，在市场上没有用于莱姆疏螺旋体病的预防性药剂，并且因此在本领域中需要开发可提供针对存在于美国、欧洲和其他地方的疏螺旋体的有效保护的这种药剂，特别是需要开发可提供同时针对若干种疏螺旋体血清型的有效保护的药剂。本专利技术的含血清型3OspA异二聚体Lip-S4D1-S3hybD1在便于生产和刺激特异性抗体这两方面改进了我们先前公开的异二聚体Lip-S4D1-S3D1(参见WO2014/006226)，如通过与血清型3疏螺旋体属螺旋体结合的抗体表面所测量的。另外，与先前公开的异二聚体相比，对新异二聚体的免疫反应的更具特异性的特性表明所述效力也更优秀。专利技术概述本专利技术涉及一种包含疏螺旋体外表面蛋白A(OspA)的杂合片段的多肽、一种编码所述多肽的核酸、一种包含此类核酸分子的载体以及一种包含此类载体的宿主细胞。此外，本专利技术提供一种用于产生此类多肽的方法和一种用于产生表达此类多肽的细胞的方法。另外，本专利技术提供特异性结合此类多肽的抗体；产生此类抗体的杂交瘤细胞；用于产生此类抗体的方法；包含此类多肽、核酸分子、载体或抗体的药物组合物；此类多肽、核酸分子、载体或抗体用于制备药剂或药物组合物(具体地用作疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其包含杂合C‑末端OspA(疏螺旋体的外表面蛋白A)片段，其中所述杂合C‑末端OspA片段从N‑末端至C‑末端方向由以下各项组成i)第一OspA部分，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125‑176或氨基酸126‑175组成，它不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段，以及ii)第二OspA部分，其由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ ID NO：8)的氨基酸176‑274或最优选氨基酸177‑274组成，其中所述第二OspA片段是突变的并且是胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中所述第二OspA片段的所述位于位置182处的半胱氨酸与所述位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且其中所述氨基酸和所述半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.09 EP 14150682.41.一种多肽，其包含杂合C-末端OspA(疏螺旋体的外表面蛋白A)片段，其中所述杂合C-末端OspA片段从N-末端至C-末端方向由以下各项组成i)第一OspA部分，其由来自疏螺旋体菌株的OspA的氨基酸125-176或氨基酸126-175组成，它不是具有SEQ ID NO：8的伽氏疏螺旋体菌株PBr的对应片段，以及ii)第二OspA部分，其由来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的OspA(SEQ ID NO：8)的氨基酸176-274或最优选氨基酸177-274组成，其中所述第二OspA片段是突变的并且是胱氨酸稳定的，其中它与对应的野生型序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置182处的野生型氨基酸以及通过半胱氨酸取代在SEQ ID NO：8的位置269处的野生型氨基酸，并且其中所述第二OspA片段的所述位于位置182处的半胱氨酸与所述位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且其中所述氨基酸和所述半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述杂合C-末端OspA片段由来自法雷斯疏螺旋体菌株VS116的氨基酸125-176和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：1)。3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述杂合C-末端OspA片段由来自斯柏曼疏螺旋体的氨基酸126-175和来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274组成(SEQ ID NO：51)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述第二OspA部分与来自伽氏疏螺旋体菌株PBr的胱氨酸稳定的氨基酸177-274相同，但与其不同之处在于用脯氨酸残基取代伽氏疏螺旋体菌株PBr野生型OspA的氨基酸233处的苏氨酸残基。5.一种多肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或者由其组成。6.一种多肽，其包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列或者由其组成。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与通过针对如SEQ ID NO：31所定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白产生的抗体引起的荧光强度相比，所述多肽实现荧光强度的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述荧光强度通过流式细胞术测量并且通过在小鼠中用所述多肽免疫三次后产生的抗体经由与血清型3疏螺旋体的表面结合来引起，具体地其中所述增加可如实施例3中所述测定。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中与如SEQ ID NO：31所定义的Lip-S4D1-S3D1异二聚体蛋白相比，所述多肽或包含所述多肽的构建体显示产率的至少1.5倍增加、优选地至少2倍增加、更优选地至少3倍增加、甚至更优选地至少4倍增加、甚至更优选地至少5倍增加、最优选地至少10倍增加，所述产率以毫克/克生物量测量，具体地其中所述增加可如实施例2中所述测定。9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其还包含第二C-末端OspA片段；其中所述OspA片段由疏螺旋体OspA蛋白的C-末端结构域组成并且是突变的和胱氨酸稳定的，其中它与所述对应的野生型OspA序列的不同之处至少在于通过半胱氨酸取代所述野生型序列位置182处的氨基酸以及通过半胱氨酸取代所述野生型序列位置269处的氨基酸，并且其中在所述OspA片段的所述位于位置182处的半胱氨酸与所述位于位置269处的半胱氨酸之间存在二硫键；并且此外其中所述OspA片段在位置123、124或125处开始并且在位置273或274处终止；并且此外其中所述氨基酸和所述半胱氨酸取代的编号是根据狭义伯氏疏螺旋体菌株B31的全长OspA(SEQ ID NO：5)的对应氨基酸的编号。10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽i)其中所述多肽是脂化的或其中所述多肽包含脂化信号，优选大肠杆菌来源的lpp脂化信号MKATKLVLGAVILGSTLLAG(SEQ ID NO：15)；和/或ii)其中所述多肽包含脂化位点肽，所述脂化位点肽前面是作为脂化位点的N-末端半胱氨酸残基，优选CSS；和/或iii)其中所述多肽包含在所述杂合C-末端OspA片段与所述第二C-末端OspA片段之间的接头，具体地其中所述接头包含GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS(SEQ ID NO：16)。11.根据权利要求9或10中任一项所述的多肽，其中所述第二C-末端OspA片段是如权利要求1至8中所述的杂合C-末端OspA片段。12.根据权利要求9至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽由Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体(SEQ ID NO：27)组成。13.一种多肽，其包含SEQ ID NO：27(Lip-S4D1-S3hybD1的异二聚体)的氨基酸序列或者由其组成。14.一种核酸，其用于编码如权利要求1至13中任一项所述的多肽，其具体地为一种包含SEQ ID NO：26的核酸序列或者由其组成的核酸。15.一种载体，其包含根据权利要求14所述的核酸分子。16.一种宿主细胞，其包含如权利要求14所述的核酸或如权利要求15所述的载体，其中所述宿主细胞优选为大肠杆菌。17.一种用于产生表达如权利要求1至13中任一项所述的多肽的细胞的方法，其包括用如权利要求15所述的载体转化或转染适合的宿主细胞。18.一种用于产生根据权利要求1至13中任一项所述的多肽的方法，其包括表达根据权利要求14所述的核酸。19.一种用于产生根据权利要求1至13中任一项所述的多肽的方法，其特征在于以下步骤：a)将编码所述多肽的载体引入到宿主细胞中；b)使所述宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长；c)使所述宿主细胞均质化；以及d)使所述宿主细胞均浆经受纯化步骤。20.一种抗体或至少其有效部分，其选择性地结合如权利要求1所述的杂合C-末端OspA片段，但并不单独结合所述第一OspA部分和所述第二OspA部分。21.根据权利要求20所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。22.根据权利要求20或21所述的抗体，其中所述有效部分包括Fab片段、F(ab)片段、F(ab)N片段、F(ab)2片段或Fv片段。23.根据权利要求20至22中任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。24.根据权利要求20至23中任一项所述的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。25.一种杂交瘤细胞系，其产生如权利要求20至24中任一项所述的抗体。26.一种用于产生如权利要求20...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔班·伦德贝格，沃尔夫冈·舒勒，
申请(专利权)人：瓦尔尼瓦奥地利有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT