本发明专利技术提出了一种检测样品中N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，该方法包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于TLC薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X‑gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。本发明专利技术实施例所提出的检测方法的实验结果可重复性显著提高、显色斑点不扩散、显色清晰、分辨率高、X‑gal用量少、检测结果保真性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法。
技术介绍
群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌之间的密度调节信号，被视为细菌的通讯语言，它在生物荧光的产生、生物膜的形成、毒理因子的分泌以及环境适应性上具有十分重要的调节作用。QS系统由自诱导分子、感应分子及下游调控蛋白组成。根据细菌性质、合成的信号分子和感应机制的不同，QS系统主要包括三类：LuxR/AI-I系统(主要是革兰氏阴性菌)，LuxS/AI-2和寡肽类系统(革兰氏阳性菌为主、阴性菌为辅)，以及适应于种间交流(intra-communication)的AI-3系统(例如微生物与植物)。AI-1和AI-2主要适用于微生物的种内交流(inter-communication)。至今，已经确认了包括AI-1和AI-2在内的多种信号分子，如酰基高丝氨酸内酯类化合物(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，寡肽类化合物、芳香醇类化合物、二酮哌嗪类化合物(di-keto-piperazines,DKP)，2-庚基-3-羟基-4-喹啉(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone PQS)以及呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)等。这些信号的存在可调节细菌自身的群体行为，以实现特定环境下的生态功能。目前，以AHL分子为代表的AI-1类信号物是研究最为广泛的一种，最先关注于医学领域，例如开发新型的抗生素替代药品，以减少微生物的耐药性。此外，应用AHL系统可以阻止毒力基因的表达，通过合成信号分子类似物，产生使信号分子灭活的降解酶或阻断信号分子的合成，来阻断感应系统，使毒力基因的表达不能够被激活，从而降低细菌的感染能力。另外，在医学中应用AHL系统的另一个典型就是利用生物膜，因为微生物膜受AHL分子的调节，AHL系统在细菌生物被膜的形成中发挥着相当大的作用。现已证实AHL系统的信号分子参与细菌生物被膜的形成、发育与成熟。若干扰该系统，就会使病原菌合成细菌生物被膜的能力降低，则形成的细菌生物被膜较薄并且易受到抗生素的攻击。因此，阻断系统的运行对阻止生物被膜的形成也具有相当大的作用，通过调控AHL系统来干扰细菌生物被膜的形成从而控制病原菌。近10年来，随着AHL认识的深入和学科交叉的发展，AHL应用的范围越来越广泛，已逐渐应用到污水治理、海洋生物抗污损、能源藻类的培养、以及水产养殖等方面。从而，为了在各个行业都能利用这一系统，针对AHL的有效检测成为了当下所亟待关心的一个技术问题。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识做出的：现有的利用薄层色谱(TLC)检测N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，是将含有报告菌株和X-gal的半固体LB培养基直接倾倒在薄层色谱板上，通过半固体LB培养基的自由扩散从而平铺固定在薄层色谱板上形成半固体LB培养基胶片，因此，现有技术中，很难保证不同操作人员在每次实验中，都能在薄层色谱板上形成厚度均匀的胶片，因此很难保证实验结果的可重复性；另外,现有技术中，半固体LB培养基在薄层平板上自由扩散和凝固过程中，水分的浸润在薄层平板上产生张力，进而会对待检的AHL物质产生稀释和扩散，造成显色点有浸润、显色圈过大、显色点有扩散、视觉效果差、分辨率低；再一方面，现有技术中，是将X-gal预先与半固体LB培养基进行混合，X-gal用量大，且X-gal与待检的AHL直接接触，有一定的假阳性结果。基于专利技术人对现有薄层色谱方法问题的发现，专利技术人尝试了预先制备半固体LB培养基胶片，再将其与薄层色谱板接触，专利技术人发现，采用这种方式，所得胶片厚度均一、胶面平整、实验结果可重复性显著提高、显色点直径小、不同显色点区分度好、显色清晰、分辨率高；并且专利技术人尝试了在形成的半固体LB培养基胶片上涂布X-gal的方式进行显色检测AHL，专利技术人发现，采用这种方式，X-gal用量显著减少，检测结果保真性显著提高。在本专利技术中，本专利技术提出了一种检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X-gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。本专利技术实施例所提出的检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，实验结果可重复性高、显色点聚焦、不同显色点区分度好、显色清晰、分辨率高、X-gal用量少、检测结果保真性高。根据本专利技术的实施例，上述检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述胶片的不同位置的高度差不超过0.5mm。本专利技术实施例的检测方法的LB半固体培养基胶片的表面平整光滑、无气泡、平整度好，厚度均一，进一步提高了本专利技术实施例所提出方法的稳定性和可重复性。根据本专利技术的实施例，所述胶片的大小是20.5*20.5cm,所述胶片的厚度是0.3～0.4cm。本专利技术实施例中的胶片在上述大小和厚度下，样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的显色更加清晰、分辨率更高。根据本专利技术的实施例，所述胶片是通过制胶槽制备的，所述制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，任选地，所述制胶板的大小是22*22cm，任选地，所述插条的高度是0.5cm。本专利技术实施例的检测方法中的胶片采用制胶槽进行制备，所得胶片的厚度均一、平整度高、易于操作，进而本专利技术实施例所提出的检测方法的实验结果的可重复性进一步提高，显色点不扩散、斑点清晰，分辨率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述报告菌株是根癌农杆菌A136菌株。碳链长度为C6～C14的AHL分子启动根癌农杆菌A136菌株的报告基因的表达，进而可使X-gal显示为蓝色，从而可通过显色底物颜色的显著变化更为直观方便地判定C6～C14的AHL分子的存在与否。根据本专利技术的实施例，所述胶片是通过以下操作制备的:(1)所述报告菌株与温度为40～50℃的半固体LB培养基进行混合；以及(2)将所得混合液进行成型处理。本专利技术实施例所提出的检测方法通过上述操作制备胶片，所得胶片中报告菌株活性高、分布均匀，进而进一步提高了本专利技术实施例检测方法的灵敏度和准确度。根据本专利技术的实施例，所述展开是在甲醇和水的流动相中进行的，任选地，所述为甲醇：水的体积比是6:4。本专利技术实施例的待检测样品AHL分子的分散度好，显色斑点的离散度好、分辨率高，进一步提高了本专利技术实施例的检测方法的灵敏度和准确度。根据本专利技术的实施例，基于1L半固体LB培养基，所述X-gal的用量是13～33mg/L。现有薄层色谱的检测方法，本专利技术实施例的检测方法中，X-gal在13～33mg/L的用量下，显色辨识度好、显色点分辨率高。根据本专利技术的实施例，所述显色反应是在28～30℃进行12～18h。在28～30℃进行12～18h的显色反应，显色反应结果分辨率好、准确度高。根据本专利技术的实施例，进一步包括：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测样品中N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，其特征在于，包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X‑gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N‑酰基‑高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。
【技术特征摘要】
1.一种检测样品中N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的方法，其特征在于，包括：(1)将预先制备的半固体LB培养基胶片置于薄层色谱板的上表面，所述半固体LB培养基胶片中含有报告菌株，所述样品预先在所述薄层色谱板上展开；(2)利用X-gal使所述胶片进行显色反应；以及(3)基于所述显色反应的结果，确定所述样品中是否含有N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶片不同位置的高度差不超过0.5mm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶片的大小是20.5*20.5cm,所述胶片的厚度是0.3～0.4cm。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胶片是通过制胶槽制备的，所述制胶槽由可拆卸的制胶板和插条组成，任选地，所述制胶板的大小是22*22cm，任选地，所述插条的高度...
【专利技术属性】
技术研发人员：周进，蔡中华，马志平，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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