本发明专利技术公开了一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法,它包括铜纳米簇原液的制备、叶酸的活化、叶酸标记铜纳米簇的制备等步骤。本发明专利技术制备的铜纳米簇具有显著的抑制MCF‑7肿瘤细胞的增殖作用,并且能促进MCF‑7细胞凋亡,证明其具有一定的抗乳腺癌肿瘤细胞的活性,动物实验结果表明,本发明专利技术能抑制MCF‑7细胞裸鼠成瘤,进一步证明了其抗肿瘤细胞活性。由于本发明专利技术的铜纳米簇采用了叶酸进行标记,因此还具有明显的靶向性,可用于乳腺癌的临床靶向治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物合成领域,具体涉及一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法。
技术介绍
乳腺癌长期以来严重影响人类公共健康。目前,乳腺癌的治疗方法有很多种,主要包括内分泌治疗、放化疗、手术切除治疗以及靶向治疗。内分泌治疗相对经济,疗效好,能被大众接受,但容易复发。放化疗通常针对性较差,病人生活质量严重下降,非首选治疗方案。手术切除可以根治乳腺癌,疗效非常好,安全性高,但影响美观,难以接受。靶向治疗和放化疗相比,提高了安全性和针对性,是目前较好的治疗方案。叶酸受体是一种跨膜单链糖蛋白,在大部分人体肿瘤细胞表面过度表达,包括乳腺癌,但其在正常细胞中表达水平很低甚至不表达。因此叶酸受体介导的抗肿瘤药物分子设计是目前肿瘤靶向治疗的热点。本专利技术设计合成了一种叶酸标记的铜纳米簇,能在体外体内抑制乳腺癌细胞的增殖,迁移,诱导乳腺癌细胞凋亡。为临床靶向治疗乳腺癌提供了新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法,采用该方法制备的铜纳米簇可抑制乳腺癌肿瘤细胞,可用于制备抗乳腺癌药物。本专利技术提供的制备方法包括以下步骤:1)铜纳米簇原液的制备:将BSA溶解在水中配成浓度为15~20mg/ml的澄清透明溶液,按照BSA∶Cu2+重量比为(10~40)∶(1~10)的比例加入铜离子,混合均匀,边搅拌边调节pH至碱性,在37~60℃下搅拌反应6~8h,然后再调节溶液pH至酸性,生成铜纳米簇沉淀,将铜纳米簇沉淀离心、分离、清洗后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并调节pH至碱性,即获得铜纳米簇原液;2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.2~0.5mg/ml的叶酸溶液,然后按体积分别加入0.5~2%的10~50mg/ml的EDC水溶液和10~50mg/ml的NHS水溶液,
在黑暗、40~60℃条件下陈化10~15h,得活化的叶酸溶液;3)叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与5~20倍体积的Tris-HCl缓冲液混合,然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合,所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的15~30倍,在黑暗,40~60℃下反应10~15h,然后调节pH至3~6,生成叶酸标记的铜纳米簇沉淀,将沉淀离心、分离、清洗后重新分散在Tris-HCl缓冲液中形成澄清透明的溶液,调节溶液的pH值至9~12,即获得叶酸标记铜纳米簇。优选地,步骤1)中,所述的BSA:Cu2+重量比为25∶5。优选地,步骤2)中,将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.4mg/ml的叶酸溶液,然后按体积分别加入1%的30mg/ml的EDC水溶液和20mg/ml的NHS水溶液。优选地,步骤3)中,所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的20倍。本专利技术的有益效果是:本专利技术制备的铜纳米簇具有显著的抑制MCF-7肿瘤细胞的增殖作用,并且能促进MCF-7细胞凋亡,证明其具有一定的抗乳腺癌肿瘤细胞的活性,动物实验结果表明,本专利技术能抑制MCF-7细胞裸鼠成瘤,进一步证明了其抗肿瘤细胞活性。由于本专利技术的铜纳米簇采用了叶酸进行标记,因此还具有明显的靶向性,可用于乳腺癌的临床靶向治疗。本专利技术提供的制备方法反应充分,产物收率和纯度高,杂质少,周期短。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术进行详细地说明。实施例11)铜纳米簇原液的制备:将BSA(牛血清白蛋白)溶解在水中配成浓度为16mg/ml的澄清透明溶液,按照BSA∶Cu2+重量比为25∶5的比例加入铜离子,混合均匀,边搅拌边加氢氧化钠调节pH值至11,在50℃下搅拌反应8h,然后再用冰醋酸调节溶液pH至4,生成铜纳米簇沉淀,将铜纳米簇沉淀离心、分离、去离子水清洗3次后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并用氢氧化钠调节溶液的pH值至11,即获得铜纳米簇原液;2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO(二甲基亚砜)中配成浓度为0.4mg/ml的叶酸溶液,然后按体积分别加入1%的30mg/ml的EDC(碳二亚胺)水溶液和20mg/ml的NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)水溶液,在黑暗、50℃条件下陈化12h,得活化的叶酸溶液;3)叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与10倍体积的Tris-HCl缓冲液混
合,然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合,所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的20倍,在黑暗,50℃下反应12h,然后再用冰醋酸调节pH至4,生成叶酸标记的铜纳米簇沉淀,将沉淀离心、分离、去离子水清洗3次后重新分散在Tris-HCl缓冲液中形成澄清透明的溶液,用氢氧化钠调节溶液的pH值至11,即获得叶酸标记铜纳米簇。实施例2叶酸标记铜纳米簇体外抑制MCF-7细胞增殖试验取生长良好的对数生长期MCF-7细胞,胰蛋白酶消化后接种到96孔板,置细胞培养箱37度,5%二氧化碳条件培养24小时。设计5个药物浓度,每个浓度4个复孔,以空白培养基为对照。给药后48小时按照MTT实验标准步骤,酶标仪测定OD值,计算细胞生长抑制率。结果如表1所示。表1叶酸标记铜纳米簇对MCF-7细胞增殖的抑制作用药物浓度(μg/ml)抑制率15%28%519%1037%2060%以上实验结果表明:本专利技术制备的铜纳米簇对MCF-7细胞的增殖具有显著抑制作用,抑制率随浓度增加而增加,当浓度达到20μg/ml时,抑制率显著增加。实施例3叶酸标记铜纳米簇促进MCF-7细胞凋亡试验培养MCF-7细胞,分别以1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml叶酸标记铜纳米簇处理细胞24小时,采用Annexin V-FITC/PI染色的方法,经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡率见表2。表2叶酸标记铜纳米簇诱导MCF-7细胞凋亡叶酸标记铜纳米簇浓度0μg/ml1μg/ml5μg/ml10μg/ml细胞凋亡率(%)1.93±0.212.82±0.384.76±0.247.34±0.49实验结果表明,本专利技术制备的铜纳米簇可显著诱导MCF-7细胞的凋亡,而且呈浓度依赖性。实施例4体内裸鼠成瘤实验造模:取对数生长期的MCF-7细胞,用PBS调整细胞浓度为108/ml。在无菌条件下将0.2ml细胞接种于Balb/c裸鼠右腋下皮下。接种后观察肿瘤生长状况,肿瘤体积长到100mm3左右进行分组,每组6只,包括模型对照组,低(1μg/ml)中(5μg/ml)高(10μg/ml)计量组。实验组每周两次瘤内注射给药,三周后剥离肿瘤组织,考察相关参数。表3叶酸标记铜纳米簇对MCF-7细胞裸鼠成瘤的抑制实验分组肿瘤重量p值(VS对照组)对照组0.75±0.26-1μg/ml给药组0.68±0.21<0.055μg/ml给药组0.42±0.20<0.0110μg/ml给药组0.36±0.14<0.01实验结果表明:本专利技术制备的铜纳米簇给药组肿瘤重量明显低于对照组。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)铜纳米簇原液的制备:将BSA溶解在水中配成浓度为15~20mg/ml的澄清透明溶液,按照BSA∶Cu2+重量比为(10~40)∶(1~10)的比例加入铜离子,混合均匀,边搅拌边调节pH至碱性,在37~60℃下搅拌反应6~8h,然后再调节溶液pH至酸性,生成铜纳米簇沉淀,将铜纳米簇沉淀离心、分离、清洗后重新溶解在Tris‑HCl缓冲液中并调节pH至碱性,即获得铜纳米簇原液;2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.2~0.5mg/ml的叶酸溶液,然后按体积分别加入0.5~2%的10~50mg/ml的EDC水溶液和10~50mg/ml的NHS水溶液,在黑暗、40~60℃条件下陈化10~15h,得活化的叶酸溶液;3)叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与5~20倍体积的Tris‑HCl缓冲液混合,然后再与步骤1)得到的铜纳米簇原液混合,所述铜纳米簇原液的体积为活化的叶酸溶液体积的15~30倍,在黑暗,40~60℃下反应10~15h,然后调节pH至3~6,生成叶酸标记的铜纳米簇沉淀,将沉淀离心、分离、清洗后重新分散在Tris‑HCl缓冲液中形成澄清透明的溶液,调节溶液的pH值至9~12,即获得叶酸标记铜纳米簇。...
【技术特征摘要】
1.一种叶酸标记铜纳米簇的制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)铜纳米簇原液的制备:将BSA溶解在水中配成浓度为15~20mg/ml的澄清透明溶液,按照BSA∶Cu2+重量比为(10~40)∶(1~10)的比例加入铜离子,混合均匀,边搅拌边调节pH至碱性,在37~60℃下搅拌反应6~8h,然后再调节溶液pH至酸性,生成铜纳米簇沉淀,将铜纳米簇沉淀离心、分离、清洗后重新溶解在Tris-HCl缓冲液中并调节pH至碱性,即获得铜纳米簇原液;2)叶酸的活化:将叶酸溶解在DMSO中配成浓度为0.2~0.5mg/ml的叶酸溶液,然后按体积分别加入0.5~2%的10~50mg/ml的EDC水溶液和10~50mg/ml的NHS水溶液,在黑暗、40~60℃条件下陈化10~15h,得活化的叶酸溶液;3)叶酸标记铜纳米簇的制备:将活化的叶酸溶液与5~20倍体积的Tris-HCl缓冲液混合...
【专利技术属性】
技术研发人员:陈勇,梁继超,骆爱玲,
申请(专利权)人:湖北大学,
类型:发明
国别省市:湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。