本发明专利技术公开了一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。本发明专利技术的二联重组蛋白包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。本发明专利技术将创伤弧菌的外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比二联灭活疫苗具有更高的相对免疫保护效果和更低的毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。
技术介绍
近20年来，我国淡水养殖鱼类出现暴发性败血症，给养殖业带来了不可估量的经济损失，研究表明该病的主要病原菌为创伤弧菌和迟顿迟钝爱德华氏菌。创伤弧菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是鳗鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡出血性败血症、肝肾肿大、烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，人工养殖的美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡均可发生。水产养殖业长期使用化学药物治疗该病，由于产生耐药性等原因，致使可用的安全药物越来越少。最近可见有关创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌全菌灭活苗和亚单位疫苗相关的研究，但要应用这些研究成果对鳗鲡进行免疫以预防多种病原菌的侵害，需要对鳗鲡进行多次注射操作，对鱼体伤害较大，且操作繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可作为疫苗使用的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。本专利技术的另一目的在于提供该二联重组蛋白的制备方法。本专利技术的一技术方案是：一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列包括SEQ ID NO 01的第457～466所示的氨基酸序列。本专利技术的另一技术方案是：一种编码所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，包括连接
在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的编码核苷酸序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别包括SEQ ID NO 02的第712～1368位和第1399～2085位所示的核苷酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的基因序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的基因序列通过一段包括SEQ ID NO 02的第1369～1398位所示的核苷酸序列编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。本专利技术的再一技术方案是：一种表达所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，包括负载有包括SEQ ID NO 02所示核苷酸序列的原核表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。本专利技术的再一技术方案是：一种表达所述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有负载包括SEQ ID NO 02所示核苷酸序列的原核表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-2T-His或pGEX-2TH-his。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。本专利技术的再一技术方案是：一种上述鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)分别扩增编码创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 02的第831～1612位和第1399～2085位所示；(2)将步骤(1)所得的两个基因序列连接在一起，得到融合基因序列；(3)将步骤(2)所得的融合基因序列连接到原核表达载体中，构建重组表达载体；(4)将步骤(3)中所构建的重组表达载体转化到原核宿主细胞中，并在适于表达所述融合基因的条件下培养被转化的原核宿主细胞；(5)回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；(6)对步骤(5)所得的融合蛋白进行复性。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术将创伤弧菌的外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；2、本专利技术的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对两种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；3、本专利技术的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。附图说明图1为本专利技术实施例2中免疫后28d创伤弧菌攻毒后的鳗鲡存活率曲线图。图2为本专利技术实施例2中免疫后28d迟顿爱德华氏菌攻毒后的鳗鲡存活率曲线图。图3为本专利技术实施例2中鳗鲡经免疫后不同时期血清特异性抗体的ELISA效价变化图。图4为本专利技术实施例2中鳗鲡经免疫后在血清、粘液、肝脏组织和肾脏组织悬液不同时期的溶菌酶的活性变化图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1本实施例进行本专利技术的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。(OMP-Vibrio-Edwa)的制备(1)选取的创伤弧菌外膜蛋白ompU和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白ompA基因中膜外区域免疫原性和亲水性均较好的DNA片段，将选取的两个片段中间用接头连接起来，设计扩增OmpU基因部分片段的上游和下游引物分别为:P1:5'CCG GAA TTC TAC GCA GGT CTA GGC GGC AAG T 3'(SEQ ID NO 03，31bp，引入EcoRⅠ位点)；P2:5'ACC CGA GCC ACC ACC GCC CGAGCC TAT ACG AGC GTA GCC AGC ACC GCC AAC T 3'(SEQ ID NO 04，52bp)；扩增OmpA部分基因的上游和下游引物分别:P3:5'TCG GGC GGT GGC GGC TCG GGT GGC GGA TCA GTA TGG CGT TCT GAT ATC CAC GG3’(SEQ ID NO 05，53bp)；P4:5'CGC GTC GAC CTG CGG CTG AGA AAC TTC TTC TT 3'(SEQ ID NO 06，32bp，引入SalⅠ位点)。上述引物均由上海捷瑞生物工程公司合成，其中引物P 2 5″端
的21个碱基(3't caa ccg cca cga ccg atg cga gca tat ccg agc ccg cca cca ccg agc cca)5'和P3 5'端21个碱基(5'tcg ggc ggt ggc ggc tcg ggt ggc gga tca gta tgg cgt tct gat atc cac gg3’)互补，中间接头共30bp。(cgtataggctcgggcggtggtggctcgggt)。以创伤弧菌的基因组DNA作为PCR反应模板,以P1和P2为引物，扩增OmpU基因片段，回收PCR产物；采用如下体系(50μL)扩增基因片段：PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃梯度退火1min(每个梯度增加一度)，72℃延伸2min，30个循本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分，其氨基酸序列分别包括SEQ ID NO 01的第238～456位和第467～695所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的一种鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列包括SEQ ID NO 01的第457～466所示的氨基酸序列。3.一种编码权利要求1所述的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，其特征在于：包括连接在一起的创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的编码核苷酸序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别包括SEQ ID NO 02的第712～1368位和第1399～2085位所示的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的一种编码鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，其特征在于：所述创伤弧菌外膜蛋白OmpU膜外部分的编码核苷酸序列和迟顿爱德华氏菌外膜蛋白OmpA膜外部分的编码核苷酸序列通过一段包括SEQ ID NO 02的第1369～1398位所示的核苷酸序列编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。5.一种表达权利要求1所述的鳗鲡创伤弧菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，其特征在于：包括负载有包括SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭松林，胡琳琳，冯建军，林鹏，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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